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tesi-magistrale
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\chapter{Apparato sperimentale}\label{cap:methods}
L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopioinvertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanicadel LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistemadi due pinzette ottiche posizionabili elettronicamente e con unoschema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungerela sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemidi illuminazione (campo largo, TIRF, HILO).
Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura\ref{fig:microscope}.

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Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e ilfunzionamento simultaneo - senza interferenze - dei tre principalischemi di microscopia e manipolazione:
\begin{description}    \item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una        sorgente LED a spettro largo viene collimata da un        condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso        il campione.        L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce        trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita del        contrasto di densità dello stesso.    \item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono        collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo,        quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono        essere usati per intrappolare e manipolare microsfere        in soluzione. La radiazione laser diffusa che attraversa        il campione e viene raccolta dal condensatore può essere        analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo        spostamento dal centro delle sfere intrappolate.    \item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene        focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e        quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La        radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione        viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso        un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio        di eccitazione.\end{description}
\begin{figure}[ht]    \centering    \includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf}    \caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi    ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.}    \label{fig:microscope}\end{figure}
Per evitare interferenze tra i tre schemi è stato necessarioscegliere opportune lunghezze d'onda per la radiazione diilluminazione e, di conseguenza, appropriati specchi dicroicie filtri.
L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando unasorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm},le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un lasera stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per lamicroscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgentilaser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} el'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccoltae disaccopiata dall'illuminazione a luce trasmessa.

\section{Microscopio e traslatori}
Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituisconoil microscopio sono assemblati su una struttura metallicapersonalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS.Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattroelastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuaresignificativamente le vibrazioni meccaniche.Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimentoattraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa.
Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarieper gli esperimenti viene caricata in una camera di reazionerealizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti).Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraversoquattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore cortoraggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il \textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}.
Per gli scopi di questa tesi sono stati usati due obiettividifferenti:
\begin{itemize}    \item Un obiettivo planapocromatico 60x a immersione ad acqua,        con alta apertura numerica ($NA = 1.22$) e distanza di lavoro        di \SI{0.2}{\mm} (Nikon)    \item Un obiettivo TIRF (??) a immersione a olio (Nikon)\end{itemize}
Il primo obiettivo presenta le caratteristiche migliori per quantoriguarda l'efficienza delle pinzette ottiche, anche a profonditàsignificative all'interno del campione.Il secondo obiettivo invece permette la realizzazione di schemi diilluminazione TIRF, al prezzo di un'efficienza delle pinzette otticheche decresce rapidamente all'aumentare del volume di campioneattraversato.
La posizione del campione rispetto al centro del percorso otticopuò essere modificata attraverso due traslatori controllatielettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, ??)per spostamenti veloci e con risoluzione nanometrica, con una corsa di\SI{100}{\um} per asse, e uno di tipo motore passo-passo(Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI{50}{\mm} per asse.
Il piano focale può essere modificato variando la posizionedell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico(Physik Instrumente, PIFOC™ ??) con con una corsa di \SI{400}{\um}e risoluzione nanometrica. Il microscopio è stato progettato in modoche al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenzadella superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campionepreparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti).
I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivosono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente?? e ??) e dotati di sensori che permettono il funzionamento inmodalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungoraggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito daGalil Motion Control e equipaggiati di un \textit{encoder} chepermette la selezione e il monitoraggio della velocità di spostamento.Le tre unità di controllo sono connesse ad un PC mediante interfacciaseriale RS232 e possono essere programmate e controllate usandoi protocolli di comunicazione GCS per i moduli Physik Instrumentee GC \cite{gclib} per il modulo Galil Motion Control.
Per semplificare l'utilizzo dei tre gli attuatori durantela manipolazione di un campione è stato sviluppato un softwarein ambiente LabVIEW che implementa i protocolli di comunicazionerichiesti.In particolare il software sviluppato consente di utilizzarelevette analogiche e cursori di un \textit{controller} della consoleXbox 360 (Microsoft) per inviare comandi agli attuatori, rendendo lamanipolazione del campione particolarmente semplice e intuitiva.
\section{Illuminazione a luce trasmessa}
La radiazione emessa da un LED ad alta intensità (Thorlabs, M780L3)con picco di emissione centrato nell'infrarosso, a \SI{780}{nm},viene filtrata con un filtro passa-basso (Thorlabs, FEHL0750) in mododa sopprimere l'emissione a lunghezze d'onda inferiori a \SI{750}{nm}che andrebbe a interferire con il rilevamento della fluorescenza.Successivamente, con l'ausilio di una singola lente e un accoppiatorein fibra (Thorlabs), la radiazione emessa dal LED e filtrataviene immessa in una fibra ottica e trasportata in corrispondenza delmicroscopio. All'altra estremità della fibra un sistema formato da uncollimatore, un diaframma e una lente aggiusta le dimensioni e ladivergenza del fascio di illuminazione, direzionandolo collimato versoil piano focale posteriore del condensatore.Il fascio di illuminazione viene quindi focalizzato sul campione, loattraversa e la radiazione trasmessa e diffusa viene raccoltadall'obiettivo.Gli obiettivi usati sono corretti all'infinito, questo significache i raggi in uscita dall'obiettivo sono collimati.Inserendo nel percorso ottico una \textit{lente di tubo} l'immagineviene messa a fuoco in un piano ben preciso.La distanza focale dell'obiettivo è di \SI{3.3}{\mm}, quella dellalente di tubo di \SI{250}{\mm}.Otteniamo quindi la formazione di un immagine del piano del campioneselezionato a una distanza di \SI{250}{\mm} dalla lente e con un fattore di ingrandimento $M = 250/3.3 \approx 75$.Questa immagine viene ulteriormente ingrandita mediante l'uso diun'ulteriore lente con distanza focale \SI{75}{\mm} posta a\SI{350}{mm} dalla lente di tubo.In questo modo si ottiene, a una distanza di \SI{30}{\cm} dall'ultimalente un ulteriore ingrandimento di un fattore $M' = $dalla lente di tubo. catturata, dopo aver attraversato un\textit{beam-splitter}, da due sensori CMOS monocromatici(Thorlabs DCC1545M).La potenza viene suddivisa tra i due sensori secondo il rapporto90:10. Il sensore che riceve la frazione maggiore di potenza saràutilizzato per il sistema attivo di stabilizzazione meccanica (descrittoin sezione \ref{sec:active_stab}), l'altro sensore verrà utilizzatoper mostrare costantemente su un monitor la situazione del campione.

\section{Fluorescenza}
\section{Pinzette ottiche}
Il fascio \textit{laser} collimato in uscita da una sorgente\ce{Nd}:\ce{YVO4} attraversa immediatamente una serie di due isolatoriottici, necessari per ridurre al minimo le instabilità della sorgentedovute alla retro-riflessione.Successivamente, dopo aver attraversato una lamina $\lambda/2$,viene diviso in due  fasci ortogonali da un cubo polarizzatore.I due fasci avranno polarizzazioni parallele o perpendicolari rispettoalla superficie del tavolo ottico, e la lamina $\lambda/2$ consente dimodificare la ripartizione di potenza tra i due rami.I due rami vengono ricombinati utilizzando un secondo cubopolarizzatore, dopo aver attraversato due modulatori acusto-ottici(\textit{Acousto Optic Modulator, AOM}).Gli AOM vengono realizzati ponendo un cristallo di quarzo in contattocon un trasduttore piezoelettrico: la radiofrequenza trasmessa altrasduttore consente l'instaurazione di un onda stazionaria acusticaall'interno del cristallo, che si comporta sostanzialmente come unreticolo di diffrazione. Variando l'ampiezza e la frequenza del segnaleelettrico inviato agli AOM è possibile modificare le caratteristichedell'onda acustica stazionaria nel cristallo, e quindi ottenere unadeflessione e una modulazione del fascio in uscita.
Gli elementi ottici sono allineati in modo che quanto a entrambigli AOM viene applicata una radiofrequenza di \SI{75}{MHz} i due ramiincidano perpendicolarmente sull'ultimo cubo polarizzatore e proseguanoil loro percorso esattamente sovrapposti (linea continua nella figura \ref{fig:aom}).
\begin{figure}[ht]    \centering    \includegraphics[width=\linewidth]{images/aom.pdf}    \caption{Caption}    \label{fig:aom}\end{figure}
Una coppia di lenti piano-convesse con distanze focali di\SIlist{??;??}{\mm} incrementa la dimensione del fascio e rende il piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il pianodelle uscite degli AOM. In questo modo, per qualsiasi deflessioneangolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappolepasseranno sempre collimati per il centro del piano focale posterioredell'obiettivo, con angolo d'incidenza dipendente dalla radiofrequenzaapplicata. I fasci, quindi, attraversano l'obiettivo e vengonofocalizzati dentro il campione propagandosi parallelamente all'asseottico principale. La variazione di angolo di incidenza nel pianofocale posteriore dell'obiettivo si tradue in uno spostamentoorizzontale dei fasci nel piano del campione: in questo modo,regolando la radiofrequenza degli AOM è possibile spostare la posizionedelle trappole lungo una linea orizzontale all'interno del campione.
I fattori di conversione tra posizione della trappola nel campione efrequenza inviata all'AOM, determinati dalle caratteristiche degli AOMe dalla geometria del sistema ottico, vengono determinati a posteriorivisualizzando microsfere intrappolate e creando rette di calibrazione.


\section{Force-clamp}

In figura \ref{fig:setup} è mostrato uno schema integraledell'apparato realizzato.Le componenti principali sono descritte nella sezione \ref{sec:setup}.Successivamente, nella sezione \ref{sec:stabilization} è descritto ilsistema di stabilizzazione meccanica introdotto per compensare lospostamentodel campione dovuto a deriva termica e oscillazioni acustiche.Nella sezione \ref{sec:calibration} è descritta nel dettaglio laprocedura usata per la calibrazione dei parametri delle trappoleottiche.
L'esperimento tipico utilizzato per studiare l'interazione tra unaproteina e un microfilamento di actina consiste in un saggio a tresfere, o \textit{3-beads assay}. I dettagli per la realizzazione diquesto esperimento sono illustrati nella sezione \ref{sec:3beads}.
\section{Apparato sperimentale}\label{sec:setup}
L'apparato sperimentale è stato realizzato presso i laboratori delLENS, sulla base dell'apparato utilizzato in precedenza dal diBiofisica di Singola Molecola per lo studio delle interazioni tramiosina e filamenti di actina e repressori della trascrizionee filamenti di DNA.
L'apparto si compone di N parti principali:\begin{description}    \item[Pinzette ottiche:] Una coppia di fasci gaussiani a \SI{1064}{\nm}, ottenuti da un laser a stato solido, \end{description}


\begin{sidewaysfigure}    \includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/Setup.pdf}    \caption{Caption}    \label{fig:setup}\end{sidewaysfigure}
\begin{sidewaystable}    \centering    \begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l}    \toprule         Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\    \midrule    \multicolumn{5}{l}{\it Fluorescence Excitation Path}\\        F-Clean635            & Bandpass Filter            & \SI{635}{\nm} laser clean-up            & $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm},
              bw: \SI{14}{\nm}$
            & FF01-640/14-25\\        L-TS1a            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope for \SI{635}{\nm} laser            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS1b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS2a            &             & Telescope for \SI{488}{\nm} laser            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS2b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        DIC-532            & Single-edge Dichroic Filter            & Excitation beam multiplexing            & $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$            & Di02-R532-25-D\\        DIC-488            & &            & $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$            & Di02-R488-25-D\\        L-TS3a            & Achromatic Doublet            & Telescope for comb. ex. lasers            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS3b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Exc            &            & Excitation beam focusing            & f: \SI{0}{\mm}             & \\        DIC-Fluor            & Quad-edge Dichroic Filter            & Excitation/Emission separation            & $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$            & Di03-R405/488/532/635-t1 \\    \multicolumn{5}{l}{\it Tweezers Path}\\        L-TS4a            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope matching isolator size            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS4b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS5a            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope after isolator            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS5b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Twz1            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope after isolator            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Twz2              & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        DIC-Twz1            & Single-edge Dichroic Filter            & Tweezer beam insertion            & $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$            & \\    \multicolumn{5}{l}{\it Imaging Path}\\        L-Im1              & Tube Lens            & Tube Lens            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Im2              & Imaging Lens            & Imaging Lens            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        DIC-BF            & Single-edge Dichroic Filter            & Fluorescence/Brightfield demux            & $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$            & FF705-Di01-25x36\\        F-BlockBF            & Shortpass Filter            & Residual brightfield suppression            & $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$            & FESH0700\\        F-Emiss            & Quad-band bandpass Filter            & Fluorophore emission filtering            & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$            & FF01-446/510/581/703\\        F-BlockTwz            & Bandstop filter            & Fluorophore emission filtering            & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$            & FF01-446/510/581/703\\     \end{tabular}     \caption{Caption}     \label{tab:my_label} \end{sidewaystable}   \section{Stabilizzazione meccanica} \label{sec:stabilization}