%%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% \chapter{Apparato sperimentale} \label{cap:methods} L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopio invertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanica del LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistema di due pinzette ottiche posizionabili elettronicamente e con uno schema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungere la sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemi di illuminazione (campo largo, TIRF, HILO). Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura \ref{fig:microscope}. %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e il funzionamento simultaneo - senza interferenze - dei tre principali schemi di microscopia e manipolazione: \begin{description} \item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una sorgente LED a spettro largo viene collimata da un condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso il campione. L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita del contrasto di densità dello stesso. \item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo, quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono essere usati per intrappolare e manipolare microsfere in soluzione. La radiazione laser diffusa che attraversa il campione e viene raccolta dal condensatore può essere analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo spostamento dal centro delle sfere intrappolate. \item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio di eccitazione. \end{description} \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf} \caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.} \label{fig:microscope} \end{figure} Per evitare interferenze tra i tre schemi è stato necessario scegliere opportune lunghezze d'onda per la radiazione di illuminazione e, di conseguenza, appropriati specchi dicroici e filtri. L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando una sorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm}, le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un laser a stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per la microscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgenti laser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} e l'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccolta e disaccopiata dall'illuminazione a luce trasmessa. \section{Microscopio e traslatori} Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituiscono il microscopio sono assemblati su una struttura metallica personalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS. Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattro elastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuare significativamente le vibrazioni meccaniche. Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimento attraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa. Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarie per gli esperimenti viene caricata in una camera di reazione realizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti). Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraverso quattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore corto raggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il \textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}. Per gli scopi di questa tesi sono stati usati due obiettivi differenti: \begin{itemize} \item Un obiettivo planapocromatico 60x a immersione ad acqua, con alta apertura numerica ($NA = 1.22$) e distanza di lavoro di \SI{0.2}{\mm} (Nikon) \item Un obiettivo TIRF (??) a immersione a olio (Nikon) \end{itemize} Il primo obiettivo presenta le caratteristiche migliori per quanto riguarda l'efficienza delle pinzette ottiche, anche a profondità significative all'interno del campione. Il secondo obiettivo invece permette la realizzazione di schemi di illuminazione TIRF, al prezzo di un'efficienza delle pinzette ottiche che decresce rapidamente all'aumentare del volume di campione attraversato. La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico può essere modificata attraverso due traslatori controllati elettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, ??) per spostamenti veloci e con risoluzione nanometrica, con una corsa di \SI{100}{\um} per asse, e uno di tipo motore passo-passo (Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI{50}{\mm} per asse. Il piano focale può essere modificato variando la posizione dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico (Physik Instrumente, PIFOC™ ??) con con una corsa di \SI{400}{\um} e risoluzione nanometrica. Il microscopio è stato progettato in modo che al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenza della superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campione preparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti). I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivo sono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente ?? e ??) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in modalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungo raggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito da Galil Motion Control e equipaggiati di un \textit{encoder} che permette la selezione e il monitoraggio della velocità di spostamento. Le tre unità di controllo sono connesse ad un PC mediante interfaccia seriale RS232 e possono essere programmate e controllate usando i protocolli di comunicazione GCS per i moduli Physik Instrumente e GC \cite{gclib} per il modulo Galil Motion Control. Per semplificare l'utilizzo dei tre gli attuatori durante la manipolazione di un campione è stato sviluppato un software in ambiente LabVIEW che implementa i protocolli di comunicazione richiesti. In particolare il software sviluppato consente di utilizzare levette analogiche e cursori di un \textit{controller} della console Xbox 360 (Microsoft) per inviare comandi agli attuatori, rendendo la manipolazione del campione particolarmente semplice e intuitiva. \section{Illuminazione a luce trasmessa} La radiazione emessa da un LED ad alta intensità (Thorlabs, M780L3) con picco di emissione centrato nell'infrarosso, a \SI{780}{nm}, viene filtrata con un filtro passa-basso (Thorlabs, FEHL0750) in modo da sopprimere l'emissione a lunghezze d'onda inferiori a \SI{750}{nm} che andrebbe a interferire con il rilevamento della fluorescenza. Successivamente, con l'ausilio di una singola lente e un accoppiatore in fibra (Thorlabs), la radiazione emessa dal LED e filtrata viene immessa in una fibra ottica e trasportata in corrispondenza del microscopio. All'altra estremità della fibra un sistema formato da un collimatore, un diaframma e una lente aggiusta le dimensioni e la divergenza del fascio di illuminazione, direzionandolo collimato verso il piano focale posteriore del condensatore. Il fascio di illuminazione viene quindi focalizzato sul campione, lo attraversa e la radiazione trasmessa e diffusa viene raccolta dall'obiettivo. Gli obiettivi usati sono corretti all'infinito, questo significa che i raggi in uscita dall'obiettivo sono collimati. Inserendo nel percorso ottico una \textit{lente di tubo} l'immagine viene messa a fuoco in un piano ben preciso. La distanza focale dell'obiettivo è di \SI{3.3}{\mm}, quella della lente di tubo di \SI{250}{\mm}. Otteniamo quindi la formazione di un immagine del piano del campione selezionato a una distanza di \SI{250}{\mm} dalla lente e con un fattore di ingrandimento $M = 250/3.3 \approx 75$. Questa immagine viene ulteriormente ingrandita mediante l'uso di un'ulteriore lente con distanza focale \SI{75}{\mm} posta a \SI{350}{mm} dalla lente di tubo. In questo modo si ottiene, a una distanza di \SI{30}{\cm} dall'ultima lente un ulteriore ingrandimento di un fattore $M' = $ dalla lente di tubo. catturata, dopo aver attraversato un \textit{beam-splitter}, da due sensori CMOS monocromatici (Thorlabs DCC1545M). La potenza viene suddivisa tra i due sensori secondo il rapporto 90:10. Il sensore che riceve la frazione maggiore di potenza sarà utilizzato per il sistema attivo di stabilizzazione meccanica (descritto in sezione \ref{sec:active_stab}), l'altro sensore verrà utilizzato per mostrare costantemente su un monitor la situazione del campione. \section{Fluorescenza} \section{Pinzette ottiche} Il fascio \textit{laser} collimato in uscita da una sorgente \ce{Nd}:\ce{YVO4} attraversa immediatamente una serie di due isolatori ottici, necessari per ridurre al minimo le instabilità della sorgente dovute alla retro-riflessione. Successivamente, dopo aver attraversato una lamina $\lambda/2$, viene diviso in due fasci ortogonali da un cubo polarizzatore. I due fasci avranno polarizzazioni parallele o perpendicolari rispetto alla superficie del tavolo ottico, e la lamina $\lambda/2$ consente di modificare la ripartizione di potenza tra i due rami. I due rami vengono ricombinati utilizzando un secondo cubo polarizzatore, dopo aver attraversato due modulatori acusto-ottici (\textit{Acousto Optic Modulator, AOM}). Gli AOM vengono realizzati ponendo un cristallo di quarzo in contatto con un trasduttore piezoelettrico: la radiofrequenza trasmessa al trasduttore consente l'instaurazione di un onda stazionaria acustica all'interno del cristallo, che si comporta sostanzialmente come un reticolo di diffrazione. Variando l'ampiezza e la frequenza del segnale elettrico inviato agli AOM è possibile modificare le caratteristiche dell'onda acustica stazionaria nel cristallo, e quindi ottenere una deflessione e una modulazione del fascio in uscita. Gli elementi ottici sono allineati in modo che quanto a entrambi gli AOM viene applicata una radiofrequenza di \SI{75}{MHz} i due rami incidano perpendicolarmente sull'ultimo cubo polarizzatore e proseguano il loro percorso esattamente sovrapposti (linea continua nella figura \ref{fig:aom}). \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=\linewidth]{images/aom.pdf} \caption{Caption} \label{fig:aom} \end{figure} Una coppia di lenti piano-convesse con distanze focali di \SIlist{??;??}{\mm} incrementa la dimensione del fascio e rende il piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il piano delle uscite degli AOM. In questo modo, per qualsiasi deflessione angolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappole passeranno sempre collimati per il centro del piano focale posteriore dell'obiettivo, con angolo d'incidenza dipendente dalla radiofrequenza applicata. I fasci, quindi, attraversano l'obiettivo e vengono focalizzati dentro il campione propagandosi parallelamente all'asse ottico principale. La variazione di angolo di incidenza nel piano focale posteriore dell'obiettivo si tradue in uno spostamento orizzontale dei fasci nel piano del campione: in questo modo, regolando la radiofrequenza degli AOM è possibile spostare la posizione delle trappole lungo una linea orizzontale all'interno del campione. I fattori di conversione tra posizione della trappola nel campione e frequenza inviata all'AOM, determinati dalle caratteristiche degli AOM e dalla geometria del sistema ottico, vengono determinati a posteriori visualizzando microsfere intrappolate e creando rette di calibrazione. \section{Force-clamp} In figura \ref{fig:setup} è mostrato uno schema integrale dell'apparato realizzato. Le componenti principali sono descritte nella sezione \ref{sec:setup}. Successivamente, nella sezione \ref{sec:stabilization} è descritto il sistema di stabilizzazione meccanica introdotto per compensare lo spostamento del campione dovuto a deriva termica e oscillazioni acustiche. Nella sezione \ref{sec:calibration} è descritta nel dettaglio la procedura usata per la calibrazione dei parametri delle trappole ottiche. L'esperimento tipico utilizzato per studiare l'interazione tra una proteina e un microfilamento di actina consiste in un saggio a tre sfere, o \textit{3-beads assay}. I dettagli per la realizzazione di questo esperimento sono illustrati nella sezione \ref{sec:3beads}. \section{Apparato sperimentale} \label{sec:setup} L'apparato sperimentale è stato realizzato presso i laboratori del LENS, sulla base dell'apparato utilizzato in precedenza dal di Biofisica di Singola Molecola per lo studio delle interazioni tra miosina e filamenti di actina e repressori della trascrizione e filamenti di DNA. L'apparto si compone di N parti principali: \begin{description} \item[Pinzette ottiche:] Una coppia di fasci gaussiani a \SI{1064}{\nm}, ottenuti da un laser a stato solido, \end{description} \begin{sidewaysfigure} \includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/Setup.pdf} \caption{Caption} \label{fig:setup} \end{sidewaysfigure} \begin{sidewaystable} \centering \begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l} \toprule Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\ \midrule \multicolumn{5}{l}{\it Fluorescence Excitation Path}\\ F-Clean635 & Bandpass Filter & \SI{635}{\nm} laser clean-up & $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm}, bw: \SI{14}{\nm}$ & FF01-640/14-25\\ L-TS1a & Plano-Convex Spherical Lens & Telescope for \SI{635}{\nm} laser & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS1b & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS2a & & Telescope for \SI{488}{\nm} laser & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS2b & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ DIC-532 & Single-edge Dichroic Filter & Excitation beam multiplexing & $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$ & Di02-R532-25-D\\ DIC-488 & & & $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$ & Di02-R488-25-D\\ L-TS3a & Achromatic Doublet & Telescope for comb. ex. lasers & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS3b & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-Exc & & Excitation beam focusing & f: \SI{0}{\mm} & \\ DIC-Fluor & Quad-edge Dichroic Filter & Excitation/Emission separation & $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$ & Di03-R405/488/532/635-t1 \\ \multicolumn{5}{l}{\it Tweezers Path}\\ L-TS4a & Plano-Convex Spherical Lens & Telescope matching isolator size & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS4b & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS5a & Plano-Convex Spherical Lens & Telescope after isolator & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS5b & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-Twz1 & Plano-Convex Spherical Lens & Telescope after isolator & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-Twz2 & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ DIC-Twz1 & Single-edge Dichroic Filter & Tweezer beam insertion & $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$ & \\ \multicolumn{5}{l}{\it Imaging Path}\\ L-Im1 & Tube Lens & Tube Lens & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-Im2 & Imaging Lens & Imaging Lens & f: \SI{0}{\mm} & \\ DIC-BF & Single-edge Dichroic Filter & Fluorescence/Brightfield demux & $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$ & FF705-Di01-25x36\\ F-BlockBF & Shortpass Filter & Residual brightfield suppression & $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$ & FESH0700\\ F-Emiss & Quad-band bandpass Filter & Fluorophore emission filtering & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$ & FF01-446/510/581/703\\ F-BlockTwz & Bandstop filter & Fluorophore emission filtering & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$ & FF01-446/510/581/703\\ \end{tabular} \caption{Caption} \label{tab:my_label} \end{sidewaystable} \section{Stabilizzazione meccanica} \label{sec:stabilization}