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- \chapter{Apparato sperimentale}
- \label{cap:setup}
-
- L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopio
- invertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanica
- del LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistema
- di due pinzette ottiche posizionabili elettronicamente e con uno
- schema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungere
- la sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemi
- di illuminazione (campo largo, TIRF, HILO).
-
- Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura
- \ref{fig:microscope}.
-
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- Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e il
- funzionamento simultaneo - senza interferenze - dei tre principali
- schemi di microscopia e manipolazione:
-
- \begin{description}
- \item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una
- sorgente LED a spettro largo viene collimata da un
- condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso
- il campione.
- L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce
- trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita del
- contrasto di densità dello stesso.
- \item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono
- collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo,
- quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono
- essere usati per intrappolare e manipolare microsfere
- in soluzione. La radiazione laser diffusa che attraversa
- il campione e viene raccolta dal condensatore può essere
- analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo
- spostamento dal centro delle sfere intrappolate.
- \item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene
- focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e
- quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La
- radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione
- viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso
- un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio
- di eccitazione.
- \end{description}
-
- \begin{figure}[ht]
- \centering
- \includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf}
- \caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi
- ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.}
- \label{fig:microscope}
- \end{figure}
-
- Per evitare interferenze tra i tre schemi è stato necessario
- scegliere opportune lunghezze d'onda per la radiazione di
- illuminazione e, di conseguenza, appropriati specchi dicroici
- e filtri.
-
- L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando una
- sorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm},
- le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un laser
- a stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per la
- microscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgenti
- laser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} e
- l'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccolta
- e disaccopiata dall'illuminazione a luce trasmessa.
-
-
- \section{Microscopio e traslatori}
-
- Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituiscono
- il microscopio sono assemblati su una struttura metallica
- personalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS.
- Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattro
- elastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuare
- significativamente le vibrazioni meccaniche.
- Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimento
- attraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa.
-
- Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarie
- per gli esperimenti viene caricata in una camera di reazione
- realizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti).
- Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraverso
- quattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore corto
- raggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il
- \textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}.
-
- Per gli scopi di questa tesi sono stati usati due obiettivi
- differenti:
-
- \begin{itemize}
- \item Un obiettivo planapocromatico 60x a immersione ad acqua,
- con alta apertura numerica ($NA = 1.22$) e distanza di lavoro
- di \SI{0.2}{\mm} (Nikon)
- \item Un obiettivo TIRF (??) a immersione a olio (Nikon)
- \end{itemize}
-
- Il primo obiettivo presenta le caratteristiche migliori per quanto
- riguarda l'efficienza delle pinzette ottiche, anche a profondità
- significative all'interno del campione.
- Il secondo obiettivo invece permette la realizzazione di schemi di
- illuminazione TIRF, al prezzo di un'efficienza delle pinzette ottiche
- che decresce rapidamente all'aumentare del volume di campione
- attraversato.
-
- La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico
- può essere modificata attraverso due traslatori controllati
- elettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, ??)
- per spostamenti veloci e con risoluzione nanometrica, con una corsa di
- \SI{100}{\um} per asse, e uno di tipo motore passo-passo
- (Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI{50}{\mm} per asse.
-
- Il piano focale può essere modificato variando la posizione
- dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico
- (Physik Instrumente, PIFOC™ ??) con con una corsa di \SI{400}{\um}
- e risoluzione nanometrica. Il microscopio è stato progettato in modo
- che al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenza
- della superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campione
- preparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti).
-
- I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivo
- sono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente
- ?? e ??) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in
- modalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungo
- raggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito da
- Galil Motion Control e equipaggiati di un \textit{encoder} che
- permette la selezione e il monitoraggio della velocità di spostamento.
- Le tre unità di controllo sono connesse ad un PC mediante interfaccia
- seriale RS232 e possono essere programmate e controllate usando
- i protocolli di comunicazione GCS per i moduli Physik Instrumente
- e GC \cite{gclib} per il modulo Galil Motion Control.
-
- Per semplificare l'utilizzo dei tre gli attuatori durante
- la manipolazione di un campione è stato sviluppato un software
- in ambiente LabVIEW che implementa i protocolli di comunicazione
- richiesti.
- In particolare il software sviluppato consente di utilizzare
- levette analogiche e cursori di un \textit{controller} della console
- Xbox 360 (Microsoft) per inviare comandi agli attuatori, rendendo la
- manipolazione del campione particolarmente semplice e intuitiva.
-
- \section{Illuminazione a luce trasmessa}
-
- La radiazione emessa da un LED ad alta intensità (Thorlabs, M780L3)
- con picco di emissione centrato nell'infrarosso, a \SI{780}{nm},
- viene filtrata con un filtro passa-basso (Thorlabs, FEHL0750) in modo
- da sopprimere l'emissione a lunghezze d'onda inferiori a \SI{750}{nm}
- che andrebbe a interferire con il rilevamento della fluorescenza.
- Successivamente, con l'ausilio di una singola lente e un accoppiatore
- in fibra (Thorlabs), la radiazione emessa dal LED e filtrata
- viene immessa in una fibra ottica e trasportata in corrispondenza del
- microscopio. All'altra estremità della fibra un sistema formato da un
- collimatore, un diaframma e una lente aggiusta le dimensioni e la
- divergenza del fascio di illuminazione, direzionandolo collimato verso
- il piano focale posteriore del condensatore.
- Il fascio di illuminazione viene quindi focalizzato sul campione, lo
- attraversa e la radiazione trasmessa e diffusa viene raccolta
- dall'obiettivo.
- Gli obiettivi usati sono corretti all'infinito, questo significa
- che i raggi in uscita dall'obiettivo sono collimati.
- Inserendo nel percorso ottico una \textit{lente di tubo} l'immagine
- viene messa a fuoco in un piano ben preciso.
- La distanza focale dell'obiettivo è di \SI{3.3}{\mm}, quella della
- lente di tubo di \SI{250}{\mm}.
- Otteniamo quindi la formazione di un immagine del piano del campione
- selezionato a una distanza di \SI{250}{\mm} dalla lente e con un
- fattore di ingrandimento $M = 250/3.3 \approx 75$.
- Questa immagine viene ulteriormente ingrandita mediante l'uso di
- un'ulteriore lente con distanza focale \SI{75}{\mm} posta a
- \SI{350}{mm} dalla lente di tubo.
- In questo modo si ottiene, a una distanza di \SI{30}{\cm} dall'ultima
- lente, un ulteriore ingrandimento di un fattore
- $M' = 300 / (350-250) = 3$.
- A questa distanza l'immagine viene
- rilevata, dopo aver diviso il cammino ottico in due rami con un
- \textit{beam-splitter}, da due sensori CMOS monocromatici
- (Thorlabs DCC1545M).
- La potenza viene suddivisa tra i due sensori secondo il rapporto
- 90:10. Il sensore che riceve la frazione maggiore di potenza sarà
- utilizzato per il sistema attivo di stabilizzazione meccanica (descritto
- in sezione \ref{sec:stabilization}), l'altro sensore verrà utilizzato
- per mostrare costantemente su un monitor la situazione del campione.
-
- I sensori CMOS usati hanno una risoluzione di \SI{1280x1024}{pixel} e
- un'area attiva di \SI{6.66x5.32}{\mm}, corrispondenti a una dimensione
- di \SI{5.2x5.2}{\um} per ogni pixel. La massima risoluzione temporale
- per acquisire un'immagine completa è di \SI{30}{fps}, ma è possibile
- ottenere risoluzioni più elevate riducendo la dimensione della regione
- d'interesse.
-
- Tenendo conto del fattore complessivo di ingrandimento
- ($75\times 3 = 225$) un'immagine completa corrisponde a una regione
- del campione \SI{30x24}{\um}, la dimensione di un singolo pixel
- corrisponde invece ad un quadrato di lato \SI{23}{\nm} sul campione.
- I valori corretti possono essere determinati solo sperimentalmente
- dopo aver fissato l'allineamento del percorso ottico e delle
- telecamere.
-
- Per ottenere i fattori reali di conversione tra pixel e dimensioni
- sul campione è stato sviluppato un programma in ampiente LabVIEW che,
- sfruttando una microsfera immobilizzata sul vetrino portaoggetti,
- consente di eseguire una calibrazione assistita.
-
-
- \section{Pinzette ottiche}
-
- Il fascio \textit{laser} collimato in uscita da una sorgente
- \ce{Nd}:\ce{YVO4} attraversa immediatamente una serie di due isolatori
- ottici, necessari per ridurre al minimo le instabilità della sorgente
- dovute alla retro-riflessione.
- Successivamente, dopo aver attraversato una lamina $\lambda/2$,
- viene diviso in due fasci ortogonali da un cubo polarizzatore.
- I due fasci avranno polarizzazioni parallele o perpendicolari rispetto
- alla superficie del tavolo ottico, e la lamina $\lambda/2$ consente di
- modificare la ripartizione di potenza tra i due rami.
- I due rami vengono ricombinati utilizzando un secondo cubo
- polarizzatore, dopo aver attraversato due modulatori acusto-ottici
- (\textit{Acousto Optic Modulator, AOM}).
- Gli AOM vengono realizzati ponendo un cristallo di diossido
- di tellurio (\ce{TeO2}) in contatto
- con un trasduttore piezoelettrico: la radiofrequenza trasmessa al
- trasduttore consente l'instaurazione di un onda stazionaria acustica
- all'interno del cristallo, che si comporta sostanzialmente come un
- reticolo di diffrazione. Variando l'ampiezza e la frequenza del
- segnale
- elettrico inviato agli AOM è possibile modificare le caratteristiche
- dell'onda acustica stazionaria nel cristallo, e quindi ottenere una
- deflessione e una modulazione del fascio in uscita.
-
- Gli elementi ottici sono allineati in modo che quanto a entrambi
- gli AOM viene applicata una radiofrequenza di \SI{75}{MHz} i due rami
- incidano perpendicolarmente sull'ultimo cubo polarizzatore e proseguano
- il loro percorso esattamente sovrapposti (linea continua nella
- figura \ref{fig:aom}).
-
- \begin{figure}[ht]
- \centering
- \includegraphics[width=\linewidth]{images/aom.pdf}
- \caption{Schema per la realizzazione di due pinzette ottiche
- indipendenti.}
- \label{fig:aom}
- \end{figure}
-
- Una coppia di lenti piano-convesse con distanze focali di
- \SIlist{??;??}{\mm} incrementa la dimensione del fascio e rende il
- piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il piano
- delle uscite degli AOM. In questo modo, per qualsiasi deflessione
- angolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappole
- passeranno sempre collimati per il centro del piano focale posteriore
- dell'obiettivo, con angolo d'incidenza dipendente dalla radiofrequenza
- applicata. I fasci, quindi, attraversano l'obiettivo e vengono
- focalizzati dentro il campione propagandosi parallelamente all'asse
- ottico principale. La variazione di angolo di incidenza nel piano
- focale posteriore dell'obiettivo si tradue in uno spostamento
- orizzontale dei fasci nel piano del campione: in questo modo,
- regolando la radiofrequenza degli AOM è possibile spostare la posizione
- delle trappole lungo una linea orizzontale all'interno del campione.
-
- I fattori di conversione tra posizione della trappola nel campione e
- frequenza inviata all'AOM, determinati dalle caratteristiche degli AOM
- e dalla geometria del sistema ottico, vengono determinati a posteriori
- visualizzando microsfere intrappolate e creando rette di calibrazione.
-
- I modulatori acusto-ottici utilizzati (AA Opto-Electronic, DTSXY-250)
- sfruttano onde acustiche di taglio e richiedono una polarizzazione
- in ingresso lineare e perpendicolare all'onda acustica.
- Per questo nel percorso ottico vengono aggiunte due ulteriori
- lamine $\lambda / 2$: una permette di aver per entrambi gli AOM la
- stessa polarizzazione in ingresso, la seconda ruota nuovamente di
- \SI{90}{\degree} la polarizzazione di uno dei due fasci in modo che
- abbiano polarizzazione ortogonali prima di ricombinarsi.
- L'intervallo di scansione angolare consentito da questi AOM è di circa
- \SI{2.8}{\degree}, corrispondenti a variazioni di \SI{50}{\MHz} nella
- radiofrequenza fornita. Lungo questo intervallo l'efficienza dell'AOM,
- ovvero la frazione di fascio deflessa nel primo ordine di diffrazione,
- può variare significativamente. Questo dipendenza può essere nociva
- per gli esperimenti con le pinzette ottiche: se l'intensità
- dei fasci non è uniforme per tutte le posizioni della trappola,
- la rigidità di essa varierà durante gli spostamenti, rendendo
- difficile la manipolazione del campione attraverso lunghe distanze e
- potenzialmente falsando i risultati degli esperimenti.
- Variando l'angolo di incidenza del fascio rispetto all'AOM è possibile
- ottimizzare questa dipendenza intorno a un intervallo di deflessioni
- angolari di nostro interesse. Resta comunque una variazione non
- trascurabile della rigidità delle trappole in funzione della posizione
- e per tenerne conto si utilizza un'apposita procedura di calibrazione
- in cui la rigidità viene misurata osservando la diffusione di una
- microsfera nella trappola, per una griglia equispaziata di punti.
-
- Per poter osservare e registrare gli spostamenti delle microsfere
- nella trappole così realizzate è stato implementato un sistema
- di rilevamento della radiazione diffusa nel piano focale posteriore
- (\textit{back-focal plane detection}, BFPD).
-
- Il profilo d'intensità della luce diffusa in avanti da una microsfera
- in una trappola ottica, rilevato nel piano focale posteriore, permette
- di conoscere la posizione relativa della microsfera rispetto al centro
- della trappola, senza dipendere (in condizioni ideali) dalla posizione
- assoluta della trappola nel campione.
-
- Per sfruttare questa proprietà la radiazione a \SI{1064}{\nm} è
- estratta dal cammino ottico successivo al condensatore grazie ad uno
- specchio dicroico. Successivamente le due polarizzazioni,
- corrispondenti alle due trappole, vengono separate da un cubo
- polarizzatore, e inviate rispettivamente a due fotodiodi a quadranti
- (\textit{Quadrant Photodiode Detector, QPD}), posizionati in un piano
- coniugato con il piano focale posteriore del condensatore.
- In questo piano la distribuzione spaziale del campo elettrico è data
- dalla trasformata di Fourier del campo in corrispondenza del piano
- del campione messo a fuoco. È possibile dimostrare che nel caso di
- una sfera spostata rispetto al centro della trappola l'asimmetria del
- profilo d'intensità nel piano focale posteriore sarà direttamente
- proporzionale allo spostamento della sfera rispetto al centro
- della trappola. Grazie ai due QPD possiamo quindi quantificare
- l'asimmetria del profilo d'intensità della radiazione diffusa
- in avanti lungo due assi ortogonali, ottenendo letture proporzionali
- agli spostamenti relativi della microsfera. Queste letture vengono
- prodotte da un sistema di amplificatori differenziali che opera
- sui quattro quadranti, producendo in uscita segnali la cui tensione,
- dopo opportuna calibrazione, può essere messa in relazione allo
- spostamento della microsfera.
-
- Maggiori dettagli sull'elettronica che consente il controllo
- della deflessione attraverso gli AOM e la lettura del segnale
- dei QPD sono forniti in appendice \ref{app:electronics}, mentre
- le procedure di calibrazione sono trattate nella sezione
- \ref{sec:calibration}.
-
- \section{Fluorescenza}
-
-
-
-
- \section{Apparto sperimentale}
-
-
- In figura \ref{fig:setup} è mostrato uno schema integrale
- dell'apparato realizzato.
- Le componenti principali sono descritte nella sezione \ref{sec:setup}.
- Successivamente, nella sezione \ref{sec:stabilization} è descritto il
- sistema di stabilizzazione meccanica introdotto per compensare lo
- spostamento
- del campione dovuto a deriva termica e oscillazioni acustiche.
- Nella sezione \ref{sec:calibration} è descritta nel dettaglio la
- procedura usata per la calibrazione dei parametri delle trappole
- ottiche.
-
- L'esperimento tipico utilizzato per studiare l'interazione tra una
- proteina e un microfilamento di actina consiste in un saggio a tre
- sfere, o \textit{3-beads assay}. I dettagli per la realizzazione di
- questo esperimento sono illustrati nella sezione
- \ref{sec:three-beads}.
-
-
- \begin{sidewaysfigure}
- \includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/Setup.pdf}
- \caption{Caption}
- \label{fig:setup}
- \end{sidewaysfigure}
-
- \begin{sidewaystable}
- \centering
- \begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l}
- \toprule
- Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\
- \midrule
- \multicolumn{5}{l}{\it Fluorescence Excitation Path}\\
- F-Clean635
- & Bandpass Filter
- & \SI{635}{\nm} laser clean-up
- & $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm},
- bw: \SI{14}{\nm}$
- & FF01-640/14-25\\
- L-TS1a
- & Plano-Convex Spherical Lens
- & Telescope for \SI{635}{\nm} laser
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- L-TS1b
- & &
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- L-TS2a
- &
- & Telescope for \SI{488}{\nm} laser
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- L-TS2b
- & &
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- DIC-532
- & Single-edge Dichroic Filter
- & Excitation beam multiplexing
- & $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$
- & Di02-R532-25-D\\
- DIC-488
- & &
- & $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$
- & Di02-R488-25-D\\
- L-TS3a
- & Achromatic Doublet
- & Telescope for comb. ex. lasers
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- L-TS3b
- & &
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- L-Exc
- &
- & Excitation beam focusing
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- DIC-Fluor
- & Quad-edge Dichroic Filter
- & Excitation/Emission separation
- & $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$
- & Di03-R405/488/532/635-t1 \\
- \multicolumn{5}{l}{\it Tweezers Path}\\
- L-TS4a
- & Plano-Convex Spherical Lens
- & Telescope matching isolator size
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- L-TS4b
- & &
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- L-TS5a
- & Plano-Convex Spherical Lens
- & Telescope after isolator
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- L-TS5b
- & &
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- L-Twz1
- & Plano-Convex Spherical Lens
- & Telescope after isolator
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- L-Twz2
- & &
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- DIC-Twz1
- & Single-edge Dichroic Filter
- & Tweezer beam insertion
- & $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$
- & \\
- \multicolumn{5}{l}{\it Imaging Path}\\
- L-Im1
- & Tube Lens
- & Tube Lens
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- L-Im2
- & Imaging Lens
- & Imaging Lens
- & f: \SI{0}{\mm}
- & \\
- DIC-BF
- & Single-edge Dichroic Filter
- & Fluorescence/Brightfield demux
- & $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$
- & FF705-Di01-25x36\\
- F-BlockBF
- & Shortpass Filter
- & Residual brightfield suppression
- & $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$
- & FESH0700\\
- F-Emiss
- & Quad-band bandpass Filter
- & Fluorophore emission filtering
- & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$
- & FF01-446/510/581/703\\
- F-BlockTwz
- & Bandstop filter
- & Fluorophore emission filtering
- & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$
- & FF01-446/510/581/703\\
- \end{tabular}
- \caption{Caption}
- \label{tab:my_label}
- \end{sidewaystable}
-
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