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tesi-magistrale
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\chapter{Apparato sperimentale}\label{cap:methods}
L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopioinvertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanicadel LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistemadi due pinzette ottiche posizionabili elettronicamente e con unoschema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungerela sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemidi illuminazione (campo largo, TIRF, HILO).
Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura\ref{fig:microscope}.

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Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e ilfunzionamento simultaneo - senza interferenze - dei tre principalischemi di microscopia e manipolazione:
\begin{description}    \item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una        sorgente LED a spettro largo viene collimata da un        condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso        il campione.        L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce        trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita del        contrasto di densità dello stesso.    \item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono        collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo,        quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono        essere usati per intrappolare e manipolare microsfere        in soluzione. La radiazione laser diffusa che attraversa        il campione e viene raccolta dal condensatore può essere        analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo        spostamento dal centro delle sfere intrappolate.    \item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene        focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e        quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La        radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione        viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso        un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio        di eccitazione.\end{description}
\begin{figure}[ht]    \centering    \includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf}    \caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi    ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.}    \label{fig:microscope}\end{figure}
Per evitare interferenze tra i tre schemi è stato necessarioscegliere opportune lunghezze d'onda per la radiazione diilluminazione e, di conseguenza, appropriati specchi dicroicie filtri.
L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando unasorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm},le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un lasera stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per lamicroscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgentilaser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} el'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccoltae disaccopiata dall'illuminazione a luce trasmessa.

\section{Microscopio e traslatori}
Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituisconoil microscopio sono assemblati su una struttura metallicapersonalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS.Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattroelastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuaresignificativamente le vibrazioni meccaniche.Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimentoattraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa.
Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarieper gli esperimenti viene caricata in una camera di reazionerealizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti).Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraversoquattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore corto raggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il \textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}.
La posizione del campione rispetto al centro del percorso otticopuò essere modificata attraverso due traslatori controllatielettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, ??)per spostamenti veloci e con precisione nanometrica, con una corsa di\SI{100}{\um} per asse, e uno di tipo motore passo-passo(Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI{50}{\mm} per asse.
Il piano focale può essere modificato variando la posizionedell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico(Physik Instrumente, PIFOC™ ??) con con una corsa di \SI{400}{\um}e risoluzione nanometrica.
I posizionatori dell

\section{Force-clamp}

In figura \ref{fig:setup} è mostrato uno schema integraledell'apparato realizzato.Le componenti principali sono descritte nella sezione \ref{sec:setup}.Successivamente, nella sezione \ref{sec:stabilization} è descritto ilsistema di stabilizzazione meccanica introdotto per compensare lospostamentodel campione dovuto a deriva termica e oscillazioni acustiche.Nella sezione \ref{sec:calibration} è descritta nel dettaglio laprocedura usata per la calibrazione dei parametri delle trappoleottiche.
L'esperimento tipico utilizzato per studiare l'interazione tra unaproteina e un microfilamento di actina consiste in un saggio a tresfere, o \textit{3-beads assay}. I dettagli per la realizzazione diquesto esperimento sono illustrati nella sezione \ref{sec:3beads}.
\section{Apparato sperimentale}\label{sec:setup}
L'apparato sperimentale è stato realizzato presso i laboratori delLENS, sulla base dell'apparato utilizzato in precedenza dal diBiofisica di Singola Molecola per lo studio delle interazioni tramiosina e filamenti di actina e repressori della trascrizionee filamenti di DNA.
L'apparto si compone di N parti principali:\begin{description}    \item[Pinzette ottiche:] Una coppia di fasci gaussiani a \SI{1064}{\nm}, ottenuti da un laser a stato solido, \end{description}


\begin{sidewaysfigure}    \includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/Setup.pdf}    \caption{Caption}    \label{fig:setup}\end{sidewaysfigure}
\begin{sidewaystable}    \centering    \begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l}    \toprule         Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\    \midrule    \multicolumn{5}{l}{\it Fluorescence Excitation Path}\\        F-Clean635            & Bandpass Filter            & \SI{635}{\nm} laser clean-up            & $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm},
              bw: \SI{14}{\nm}$
            & FF01-640/14-25\\        L-TS1a            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope for \SI{635}{\nm} laser            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS1b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS2a            &             & Telescope for \SI{488}{\nm} laser            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS2b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        DIC-532            & Single-edge Dichroic Filter            & Excitation beam multiplexing            & $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$            & Di02-R532-25-D\\        DIC-488            & &            & $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$            & Di02-R488-25-D\\        L-TS3a            & Achromatic Doublet            & Telescope for comb. ex. lasers            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS3b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Exc            &            & Excitation beam focusing            & f: \SI{0}{\mm}             & \\        DIC-Fluor            & Quad-edge Dichroic Filter            & Excitation/Emission separation            & $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$            & Di03-R405/488/532/635-t1 \\    \multicolumn{5}{l}{\it Tweezers Path}\\        L-TS4a            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope matching isolator size            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS4b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS5a            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope after isolator            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS5b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Twz1            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope after isolator            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Twz2              & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        DIC-Twz1            & Single-edge Dichroic Filter            & Tweezer beam insertion            & $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$            & \\    \multicolumn{5}{l}{\it Imaging Path}\\        L-Im1              & Tube Lens            & Tube Lens            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Im2              & Imaging Lens            & Imaging Lens            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        DIC-BF            & Single-edge Dichroic Filter            & Fluorescence/Brightfield demux            & $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$            & FF705-Di01-25x36\\        F-BlockBF            & Shortpass Filter            & Residual brightfield suppression            & $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$            & FESH0700\\        F-Emiss            & Quad-band bandpass Filter            & Fluorophore emission filtering            & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$            & FF01-446/510/581/703\\        F-BlockTwz            & Bandstop filter            & Fluorophore emission filtering            & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$            & FF01-446/510/581/703\\     \end{tabular}     \caption{Caption}     \label{tab:my_label} \end{sidewaystable}   \section{Stabilizzazione meccanica} \label{sec:stabilization}