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tesi-magistrale
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\chapter{Apparato sperimentale}\label{cap:methods}
L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopioinvertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanicadel LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistemadi due pinzette ottiche posizionabili elettronicamente e con unoschema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungerela sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemidi illuminazione (campo largo, TIRF, HILO).
Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura\ref{fig:microscope}.

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Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e ilfunzionamento simultaneo - senza interferenze - dei tre principalischemi di microscopia e manipolazione:
\begin{description}    \item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una        sorgente LED a spettro largo viene collimata da un        condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso        il campione.        L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce        trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita del        contrasto di densità dello stesso.    \item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono        collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo,        quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono        essere usati per intrappolare e manipolare microsfere        in soluzione. La radiazione laser diffusa che attraversa        il campione e viene raccolta dal condensatore può essere        analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo        spostamento dal centro delle sfere intrappolate.    \item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene        focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e        quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La        radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione        viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso        un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio        di eccitazione.\end{description}
\begin{figure}[ht]    \centering    \includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf}    \caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi    ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.}    \label{fig:microscope}\end{figure}
Per evitare interferenze tra i tre schemi è stato necessarioscegliere opportune lunghezze d'onda per la radiazione diilluminazione e, di conseguenza, appropriati specchi dicroicie filtri.
L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando unasorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm},le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un lasera stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per lamicroscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgentilaser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} el'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccoltae disaccopiata dall'illuminazione a luce trasmessa.

\section{Microscopio e traslatori}
Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituisconoil microscopio sono assemblati su una struttura metallicapersonalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS.Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattroelastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuaresignificativamente le vibrazioni meccaniche.Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimentoattraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa.
Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarieper gli esperimenti viene caricata in una camera di reazionerealizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti).Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraversoquattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore corto raggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il \textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}.
Gli obiettivi che sono stati alternativamente usati per gli scopi diquesta tesi sono: ??, ??.

La posizione del campione rispetto al centro del percorso otticopuò essere modificata attraverso due traslatori controllatielettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, ??)per spostamenti veloci e con risoluzione nanometrica, con una corsa di\SI{100}{\um} per asse, e uno di tipo motore passo-passo(Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI{50}{\mm} per asse.
Il piano focale può essere modificato variando la posizionedell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico(Physik Instrumente, PIFOC™ ??) con con una corsa di \SI{400}{\um}e risoluzione nanometrica. Il microscopio è stato progettato in modoche al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenzadella superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campionepreparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti).
I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivosono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente?? e ??) e dotati di sensori che permettono il funzionamento inmodalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungoraggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito daGalil Motion control e equipaggiati di un \textit{encoder} che permettela selezione e il monitoraggio della velocità di spostamento.Le tre unità di controllo sono connesse ad un PC mediante interfacciaseriale RS232 e possono essere programmate e controllate usandoi protocolli di comunicazione GCS per i moduli Physik Instrumentee GC \cite{gclib} per il modulo Galil Motion Control.
Per semplificare l'utilizzo dei tre gli attuatori durantela manipolazione di un campione è stato sviluppato un softwarein ambiente LabVIEW che implementa i protocolli di comunicazionerichiesti.In particolare il software sviluppato consente di utilizzarelevette analogiche e cursori di un \textit{controller} della consoleXbox 360 (Microsoft) per inviare comandi agli attuatori, rendendo lamanipolazione del campione particolarmente semplice e intuitiva.
\section{Illuminazione a luce trasmessa}
La radiazione emessa da un LED ad alta intensità (Thorlabs, M780L3)con picco di emissione centrato nell'infrarosso, a \SI{780}{nm},viene filtrata con un filtro passa-basso (Thorlabs, FEHL0750) in mododa sopprimere l'emissione a lunghezze d'onda inferiori a \SI{750}{nm}che andrebbe a interferire con il rilevamento della fluorescenza.Successivamente, con l'ausilio di una singola lente e un accoppiatorein fibra (Thorlabs), la radiazione emessa dal LED e filtrataviene immessa in una fibra ottica e trasportata in corrispondenza delmicroscopio. All'altra estremità della fibra un sistema formato da uncollimatore, un diaframma e una lente aggiusta le dimensioni e ladivergenza del fascio di illuminazione, direzionandolo collimato versoil piano focale posteriore del condensatore.Il fascio di illuminazione viene quindi focalizzato sul campione, loattraversa e la radiazione trasmessa e diffusa viene raccoltadall'obiettivo.Gli obiettivi usati sono corretti all'infinito, questo significache i raggi in uscita dall'obiettivo sono collimati.Inserendo nel percorso ottico una \textit{tube lens} l'immagineviene messa a fuoco in un piano ben preciso. L'immagine del campionecosì formata, il cui ingrandimento dipende dal rapporto tra la lunghezzafocale dell'obiettivo e quella della tube lens, viene ulteriormenteingrandita mediante l'uso di una terza lente e catturata, dopo averattraversato un \textit{beam-splitter}, da due sensori CMOSmonocromatici (Thorlabs DCC1545M).La potenza viene suddivisa tra i due sensori secondo il rapporto90:10. Il sensore che riceve la frazione maggiore di potenza saràutilizzato per il sistema attivo di stabilizzazione meccanica (descrittoin sezione \ref{sec:active_stab}), l'altro sensore verrà utilizzatoper mostrare costantemente su un monitor la situazione del campione.

\section{Fluorescenza}
\section{Pinzette ottiche}
Il fascio \textit{laser} collimato in uscita da una sorgente\ce{Nd}:\ce{YVO4} attraversa una serie di due isolatori ottici, e,dopo aver attraversato una lamina $\lambda/2$, viene diviso in due fasci ortogonali da un cubo polarizzatore. I due fasci avrannopolarizzazioni parallele o perpendicolari rispetto alla superficiedel tavolo ottico, e la lamina $\lambda/2$ consente di modificarela ripartizione di potenza tra i due rami.

\section{Force-clamp}

In figura \ref{fig:setup} è mostrato uno schema integraledell'apparato realizzato.Le componenti principali sono descritte nella sezione \ref{sec:setup}.Successivamente, nella sezione \ref{sec:stabilization} è descritto ilsistema di stabilizzazione meccanica introdotto per compensare lospostamentodel campione dovuto a deriva termica e oscillazioni acustiche.Nella sezione \ref{sec:calibration} è descritta nel dettaglio laprocedura usata per la calibrazione dei parametri delle trappoleottiche.
L'esperimento tipico utilizzato per studiare l'interazione tra unaproteina e un microfilamento di actina consiste in un saggio a tresfere, o \textit{3-beads assay}. I dettagli per la realizzazione diquesto esperimento sono illustrati nella sezione \ref{sec:3beads}.
\section{Apparato sperimentale}\label{sec:setup}
L'apparato sperimentale è stato realizzato presso i laboratori delLENS, sulla base dell'apparato utilizzato in precedenza dal diBiofisica di Singola Molecola per lo studio delle interazioni tramiosina e filamenti di actina e repressori della trascrizionee filamenti di DNA.
L'apparto si compone di N parti principali:\begin{description}    \item[Pinzette ottiche:] Una coppia di fasci gaussiani a \SI{1064}{\nm}, ottenuti da un laser a stato solido, \end{description}


\begin{sidewaysfigure}    \includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/Setup.pdf}    \caption{Caption}    \label{fig:setup}\end{sidewaysfigure}
\begin{sidewaystable}    \centering    \begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l}    \toprule         Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\    \midrule    \multicolumn{5}{l}{\it Fluorescence Excitation Path}\\        F-Clean635            & Bandpass Filter            & \SI{635}{\nm} laser clean-up            & $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm},
              bw: \SI{14}{\nm}$
            & FF01-640/14-25\\        L-TS1a            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope for \SI{635}{\nm} laser            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS1b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS2a            &             & Telescope for \SI{488}{\nm} laser            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS2b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        DIC-532            & Single-edge Dichroic Filter            & Excitation beam multiplexing            & $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$            & Di02-R532-25-D\\        DIC-488            & &            & $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$            & Di02-R488-25-D\\        L-TS3a            & Achromatic Doublet            & Telescope for comb. ex. lasers            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS3b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Exc            &            & Excitation beam focusing            & f: \SI{0}{\mm}             & \\        DIC-Fluor            & Quad-edge Dichroic Filter            & Excitation/Emission separation            & $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$            & Di03-R405/488/532/635-t1 \\    \multicolumn{5}{l}{\it Tweezers Path}\\        L-TS4a            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope matching isolator size            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS4b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS5a            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope after isolator            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-TS5b            & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Twz1            & Plano-Convex Spherical Lens            & Telescope after isolator            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Twz2              & &             & f: \SI{0}{\mm}            & \\        DIC-Twz1            & Single-edge Dichroic Filter            & Tweezer beam insertion            & $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$            & \\    \multicolumn{5}{l}{\it Imaging Path}\\        L-Im1              & Tube Lens            & Tube Lens            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        L-Im2              & Imaging Lens            & Imaging Lens            & f: \SI{0}{\mm}            & \\        DIC-BF            & Single-edge Dichroic Filter            & Fluorescence/Brightfield demux            & $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$            & FF705-Di01-25x36\\        F-BlockBF            & Shortpass Filter            & Residual brightfield suppression            & $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$            & FESH0700\\        F-Emiss            & Quad-band bandpass Filter            & Fluorophore emission filtering            & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$            & FF01-446/510/581/703\\        F-BlockTwz            & Bandstop filter            & Fluorophore emission filtering            & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$            & FF01-446/510/581/703\\     \end{tabular}     \caption{Caption}     \label{tab:my_label} \end{sidewaystable}   \section{Stabilizzazione meccanica} \label{sec:stabilization}