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@ -8,7 +8,7 @@ ruolo importante nel determinare il corretto funzionamento di cellule,
tessuti e organismi complessi. tessuti e organismi complessi.
Mentre tradizionalmente la biologia si è occupata di studiare come Mentre tradizionalmente la biologia si è occupata di studiare come
processi cellulari e inter-cellulari fossero regolati dallo scambio
processi cellulari e intercellulari fossero regolati dallo scambio
di molecole biologiche, il ruolo degli stimoli meccanici è stato a di molecole biologiche, il ruolo degli stimoli meccanici è stato a
lungo ritenuto marginale nella descrizione di questi processi. lungo ritenuto marginale nella descrizione di questi processi.
@ -278,38 +278,35 @@ tra un certo numero di proteine interagenti.
\label{fig:tj} \label{fig:tj}
\end{figure} \end{figure}
Diverse proteine attraversano la membrana e dimerizzano
con le loro omologhe appartenenti alla cellula adiacente,
tra le quali \emph{claudina}, \emph{occludina} e diverse
proteine appartenenti alla classe delle \textit{junctional
adhesion molecules}, (JAM).
Queste proteine di membrana si legano alla proteina
\textit{Zona occludens 1}, ZO-1 che, come mostrato da
recenti studi \cite{??}, potrebbe modulare la formazione
delle giunzioni e occuparsi della trasduzione di segnali
meccanici.
Inoltre vi sono evidenze sul ruolo di una terza proteina,
la \textit{cingulina}, nel modulare l'interazione di ZO-1
con il citoscheletro di actina. Un'ipotesi è che il
legame cingulina-ZO-1 possa indurre delle modifiche
conformazionali in ZO-1 tali da consentire un legame
diretto con in filamenti di actina.
Anche in questo caso, per comprendere il ruolo della cingulina
nella trasduzione dei segnali meccanici, sembra promettente
utilizzare una tecnica che consenta, durante l'osservazione
dell'interazione di due proteine sottoposte a stress
meccanici, di osservare l'eventuale attaccamento al complesso
di una terza proteina. Ad esempio sarebbe possibile ipotizzare
un esperimento in cui allo studio dell'effetto delle sollecitazioni
meccaniche sul legame actina-ZO-1 viene aggiunta l'osservazione
dell'attività della cingulina attraverso microscopia di fluorescenza.
Diverse proteine attraversano la membrana e dimerizzano con le loro
omologhe appartenenti alla cellula adiacente, tra le quali
\emph{claudina}, \emph{occludina} e diverse proteine appartenenti
alla classe delle \textit{junctional adhesion molecules}, (JAM).
Queste proteine di membrana si legano alla proteina \textit{Zona
occludens 1}, ZO-1 che, come mostrato da recenti studi \cite{??},
potrebbe modulare la formazione delle giunzioni e occuparsi della
trasduzione di segnali meccanici.
Inoltre vi sono evidenze sul ruolo di una terza proteina, la
\textit{cingulina}, nel modulare l'interazione di ZO-1 con il
citoscheletro di actina. Un'ipotesi è che il legame cingulina-ZO-1
possa indurre delle modifiche conformazionali in ZO-1 tali da
consentire un legame diretto con in filamenti di actina.
Anche in questo caso, per comprendere il ruolo della cingulina nella
trasduzione dei segnali meccanici, sembra promettente utilizzare una
tecnica che consenta, durante l'osservazione dell'interazione di due
proteine sottoposte a stress meccanici, di osservare l'eventuale
attaccamento al complesso di una terza proteina. Ad esempio sarebbe
possibile ipotizzare un esperimento in cui allo studio dell'effetto
delle sollecitazioni meccaniche sul legame actina-ZO-1 viene aggiunta
l'osservazione dell'attività della cingulina attraverso microscopia
di fluorescenza.
\section{Manipolazione ottica di molecole biologiche} \section{Manipolazione ottica di molecole biologiche}
\label{sec:ot} \label{sec:ot}
Le pinzette ottiche (o \textit{optical tweezers}, OT) sono strumenti
Le pinzette ottiche (o \textit{optical tweezer}, OT) sono strumenti
che sfruttano la \emph{forza di radiazione} esercitata da un fascio che sfruttano la \emph{forza di radiazione} esercitata da un fascio
laser gaussiano altamente focalizzato su materiali dielettrici, in laser gaussiano altamente focalizzato su materiali dielettrici, in
modo da intrappolare e manipolare oggetti microscopici con una modo da intrappolare e manipolare oggetti microscopici con una
@ -344,12 +341,12 @@ intendiamo studiare.
Tipicamente esperimenti di questo tipo vengono realizzati utilizzando Tipicamente esperimenti di questo tipo vengono realizzati utilizzando
sfere dielettriche di dimensioni micrometriche funzionalizzate legando sfere dielettriche di dimensioni micrometriche funzionalizzate legando
covalentemente molecole di \textit{streptavidina} alla loro covalentemente molecole di \textit{streptavidina} alla loro
superificie.
superficie.
In questo modo è possibile successivamente ottenere il legame delle In questo modo è possibile successivamente ottenere il legame delle
microsfere col polimero biologico d'interesse, purché esso sia stato microsfere col polimero biologico d'interesse, purché esso sia stato
preventivamente biotilinato. Si sfrutta in questo modo il legame
streptavidina-biotina, estremamente stabile e praticamente
preventivamente legato a molecole di biotina (biotilinato).
Si sfrutta in questo modo il legame streptavidina-biotina, estremamente stabile e praticamente
irreversibile (vedi figura \ref{fig:biotin-streptavidin}). irreversibile (vedi figura \ref{fig:biotin-streptavidin}).
\begin{figure}[ht] \begin{figure}[ht]


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chapters/2-methods.tex View File

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%%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%%
\chapter{Metodi}
\chapter{Apparato sperimentale}
\label{cap:methods} \label{cap:methods}
L'apparato sperimentale consiste in un microscopio inverito, montato
\section{Force-clamp} \section{Force-clamp}


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