@ -364,7 +364,7 @@ confrontata con la funzione teorica.
Dai valori di $k$ e $\beta$ estratti per tutte le posizioni di ciascuna
trappola è possibile interpolare i valori per ogni possibile posizione
intermeda. Per fare questo si usano delle funzioni polinomiali di ordine 3,
intermedia. Per fare questo si usano delle funzioni polinomiali di ordine 3,
come mostrato in figura \ref{fig:trap_ccurves}.
\begin{figure}[htpb]
@ -378,10 +378,10 @@ come mostrato in figura \ref{fig:trap_ccurves}.
\label{sec:force-clamp}
Un esperimento di \textit{force-clamp} consiste nello studiare la
dinamica e della formazione e della rottura del legame tra due
dinamica della formazione e della rottura del legame tra due
molecole quando queste sono sottoposte a una determinata
forza di trazione costante.
Per poter applicare una tale forza attraverso una microsfera catturata
Per poter applicare una tale forza tramite una microsfera catturata
in una pinzetta ottica è stato implementato un sistema di retroazione
tra la lettura della posizione relativa della microsfera nella
trappola (dai QPD) e la posizione della trappola nel campione (tramite
@ -389,17 +389,22 @@ gli AOM).
Scelto un valore per la forza (F) si può ricavare, conoscendo il
valore di $k$, il corrispondente spostamento $\Delta x$ rispetto al
centro della trappola.
Comandando agli AOM uno spostamento della trappola proporzionale
alla differenza tra la posizione relativa attuale della microsfera
nella e quella necessaria per ottenere la forza $F$ possono
verificarsi due situazioni:
Per ottenere un valore forza applicata $F$ è necessario porsi
nella condizione in cui la microsfera si è spostata di $-k/F$ dalla
posizione di equilibrio.
Se definiamo questa posizione come $x_{SET}$ e avviamo un ciclo di
retroazione in cui
comandandiamo agli AOM uno spostamento della trappola proporzionale
alla differenza tra la posizione, rilevata dai QPD, della microsfera e
$x_{SET}$, possono verificarsi i due seguenti casi:
\begin{itemize}
\item Nel caso in cui la microsfera sia libera in soluzione,
ovvero non vi sia applicata alcuna forza esterna, essa tenderà
a muoversi sempre verso il centro della trappola (la sua posizione
di equilibrio). Il sistema di retroazione quindi, per mantenere
la sfera in un punto di non equilibrio a distanza $\Delta x$ dalla
posizione di riposo dovrà continuare a muovere indefinitamente
posizione di riposo, dovrà continuare a muovere indefinitamente
la posizione della trappola nella stessa direzione.
\item Nel caso in cui la microsfera si leghi a delle molecole
immobilizzate sulla superficie del campione, lo spostamento delle
@ -437,14 +442,14 @@ di tipo FPGA (\textit{Field Programmable Gate Array}), per controllare
il ciclo di retroazione.
In questo modo è possibile leggere i valori di posizione e aggiustare
il segnale generato per gli AOM a una frequenza di \SI{200}{\kHz}, pari
al dobbio della larghezza di banda dei diodi usati nei QPD.
al doppio della larghezza di banda dei diodi usati nei QPD.
La scheda FPGA (National Instruments) è stata programmata con un codice
progettato in ambiente LabVIEW, e comunica con un apposito programma
in esecuzione sul PC di controllo dell'esperimento per configurare i
parametri sperimentali e memorizzare i tracciati (\texttt{Force-Clamp Control}).
In figura \ref{fig:forceclamp-feedback} è mostrato una schema
In figura \ref{fig:forceclamp-feedback} è mostrato uno schema
semplificato del ciclo di retroazione implementato per ciascuna
trappola.
@ -458,12 +463,15 @@ trappola.
\section{Saggio a tre sfere}
\label{sec:three-beads}
Visto che nelle giunzioni aderenti la trasmissione degli sforzi
meccanici è spesso media tra proteine filamentose (come la
\textit{F-actina}) risulta particolarmente utile sviluppare un
saggio in cui, usando due trappole, è possibile mettere in tensione
una proteina filamentosa, simulando ad esempio lo stato in cui si
può trovare la \textit{F-actina} nel citoscheletro.
Nelle giunzioni aderenti la trasmissione degli sforzi
meccanici è spesso mediata da proteine filamentose (come la
\textit{F-actina}).
Per utilizzare questo tipo di proteine negli esperimenti di \textit{force-clamp}
risulta particolarmente utile sviluppare un tipo di misura in cui,
usando due trappole, è possibile mettere in tensione una proteina filamentosa,
legando le sue estremità a due microsfere intrappolate.
In questo modo possiamo fare interagire altre proteine. ad esempio immobilizzate
sul vetrino coprioggeti, con l'actina messa in tensione e sospesa tra le due trappole.
\begin{figure}[h]
\centering
@ -494,12 +502,12 @@ trappole si muovono indefinitamente per ``inseguire'' la posizione
corrispondente alla forza richiesta. (c) Il filamento si lega con
una molecola immobilizzata sul vetrino, la microsfera raggiunge la
posizione target e lo spostamento delle trappole si arresta. La forza
applicata sul legame è pari a quella selezionata}.
applicata sul legame è pari a quella selezionata.}
\label{fig:three_beads}
\end{figure}
In figura \ref{fig:three_beads} è rappresentato lo schema realizzato.
In mancanza di legame il sistema continuerebbe a muovere le trappole
In mancanza di legame, il sistema continuerebbe a muovere le trappole
indefinitamente fino a raggiungere regioni dove l'efficienza
di intrappolamento non è più sufficiente oppure a esaurire l'intervallo
di deflessioni ottenibili con gli AOM.
@ -508,7 +516,7 @@ delle trappole in un intervallo di qualche \si{nm}, implementando
un sistema di ``riflessione'': quando il fascio che sta tentando di
applicare la forza selezionata $\Delta F$ si è spostato di un determinato
cammino massimo, si scambia il ruolo delle due trappole e si applica
un comanda un incremento di forza $-\Delta F$ sulla trappola che prima
un incremento di forza $-\Delta F$ sulla trappola che prima
era passiva. In questo modo la tensione applicata sul sistema meccanico
è uguale in modulo e opposta in verso. Inoltre il sistema può continuare
ad acquisire dati autonomamente per lunghi intervalli di tempo senza
@ -518,21 +526,21 @@ Uno schema di questo tipo è già stato utilizzato per lo studio
dell'interazione di motori molecolari (come la \textit{miosina}) e
filamenti di \textit{actina}.
Nello studio delle giunzioni cellulari sono ipotizzabili numerosi
esperimenti in cui l'interazione di uno o più fattori coinvolti
nel complesso delle adesioni sia fatti interagire con un filamento
esperimenti in cui uno o più fattori appartenenti ai complessi
di giunzione siano fatti interagire con un filamento
di actina teso tra le due trappole.
\section{Fluorescenza di singola molecola.}
\section{Fluorescenza di singola molecola}
\label{sec:single_molecule_fluorescence}
L'apparato sperimentale consente, in parallelo all'esecuzione di
un esperimento di \textit{force-clamp}, di eccitare la fluorescenza
del campione alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm}.
Anche il sistema di stabilizzazione attiva (che usa una
transilluminazione a lunghezze d'onda $ >\SI{700}{\nm}$ può essere
transilluminazione a lunghezze d'onda $ >\SI{700}{\nm}$) può essere
mantenuto attivo contemporaneamente, visto che le finestra
di eccitazione e emissione scelte sono a lunghezze d'onda inferiori.
di eccitazione ed emissione scelte sono a lunghezze d'onda inferiori.
I filtri dicroici utilizzati (vedi tabella \ref{tab:optical_components})
permettono di osservare radiazione di fluorescenza emessa nelle
@ -549,8 +557,8 @@ finestre riportate in tabella \ref{tab:fluo_lambda}:
\num{635}&\numrange{663.0}{700.0}&\num{2.4}\\
\bottomrule
\end{tabular}
\caption{Lunghezze d'onda di eccitazione e emissione compatibili con l'apparato sperimentale, e potenza
elettromagnetica toatale immessa nel campo visivo.}
\caption{Lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione compatibili con l'apparato sperimentale, e potenza
elettromagnetica totale immessa nel campo visivo.}
\label{tab:fluo_lambda}
\end{table}
@ -561,15 +569,15 @@ di impostare l'emissione di tutte le sorgenti laser in modo da avere sempre
$\SI{1}{\mW}$ di potenza ottica sul campione.
Per rendere uniforme la distribuzione di potenza nel campo visivo si tronca il
fascio gaussiano prima di focalizzarlo sull'obiettivo a un raggio pari circa
a 1/15 di quello iniziale (corrispondente a una regione sul campione pari al
campo visivo).
a 1/15 di quello iniziale (corrispondente alle dimensione del
campo visivo sul campione).
In questo modo le deviazione massima d'intensità tra i bordi e il centro
della regione illuminata è ridotta al \SI{17}{\percent} (figura \ref{fig:flatfield}).
\begin{figure}[ht]
\centering
\includegraphics{images/flatfield.png}
\caption{Simulazione della distribuzione spaziale intensità \textit{laser} sul campione. Nell'inserto viene evidenziate la regione corrispondente al campo
\caption{Simulazione della distribuzione spaziale intensità \textit{laser} sul campione. Nell'inserto viene evidenziata la regione corrispondente al campo
lorenzo.zolfanelli93
4 years ago
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