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@@ -4,13 +4,17 @@
 \section{Stabilizzazione meccanica}
 \label{sec:stabilization}
 
-Nonostante l'isolamento meccanico fornito dagli elastomeri e dal
-tavolo ottico la posizione del campione rispetto al centro
-dell'obiettivo e la quota del piano focale sono soggette a
-fluttuazioni e derive.
+
+L'isolamento meccanico fornito dagli elastomeri e dal
+tavolo ottico non è sufficiente a
+mantenere la posizione del campione stabile al livello di precisione
+del nanometro, precludendo la possibilità di poter eseguire misurazioni
+di forza con la sensibilità del $\pN$.
+
 Gli effetti più evidenti e rilevabili sono rapide oscillazioni della
-posizione del campione dovute a vibrazioni acustiche residue e una
-progressive deriva rispetto alla posizione fissata che diventa
+posizione del campione dovute a vibrazioni acustiche residue e, quando
+queste non vengono corrette, una
+progressiva deriva rispetto alla posizione fissata che diventa
 significativa  ($> \SI{100}{\nm}$) per tempi di osservazione di
 diversi minuti.
 
@@ -19,7 +23,7 @@ diverse microsfere in silice, di diametro \SI{0.5}{\um}, vengono
 immobilizzate in uno strato di nitrocellulosa depositato nella
 superficie interna del vetrino coprioggetti.
 Le varie fasi per la preparazione di questo campione sono descritte
-nei particolari nell'appendice \ref{app:protocols}, protocollo
+in dettaglio nell'appendice \ref{app:protocols}, protocollo
 \ref{proto:silica_beads_flow_cell}.
  
 Le microsfere immobilizzate nel campione possono essere messe a fuoco
@@ -42,9 +46,9 @@ si sceglie di effettuare il calcolo del centroide limitando la regione
 dell'immagine utilizzata a un rettangolo nel quale una microsfera è
 sufficientemente isolata.
  
-Ricalcolando il centroide intervalli temporali fissati è possibile
+Ricalcolando il centroide a intervalli temporali fissati è possibile
 osservare la deriva della posizione (x, y) della microsfera.
-Inoltre è possibile sfruttare questo stesso campione per effettuare
+Inoltre si ha la possibilità sfruttare questo stesso campione per effettuare
 una calibrazione del fattore di conversione pixel/nm lungo due assi 
 ortogonali.
 
@@ -56,23 +60,23 @@ centroide si ottiene il rapporto tra lo spostamento comandato al
 traslatore (in \si{\nm}) e la variazione del centroide (in pixel).
 Ripetendo questa operazione in sequenza per vari punti si ottiene
 una curva di calibrazione per l'asse scansionata, dalla quale è
-possibile estratte la costante di proporzionalità con un \textit{fit}
+possibile estrarre la costante di proporzionalità con un \textit{fit}
 lineare.
 
 Risulta più complesso invece stimare la deriva del piano focale:
-per questo motivo è stato sviluppato un metodo per determinare a
-partire dalle immagini un valore che sia linearmente proporzionale
+per questo motivo è stato sviluppato un metodo per determinare, a
+partire dalle immagini, un valore che sia linearmente proporzionale
 alla quota del piano focale rispetto al  centro della sfera.
 Il metodo sviluppato sfrutta le caratteristiche dalla distribuzione
 radiale della luce diffusa dalla microsfera.
 
-In figura \ref{fig:radial_itensity} rappresentato l'andamento del
-profilo radiale variando la quota del piano focale (z).
+In figura \ref{fig:radial_itensity} è rappresentato l'andamento del
+profilo radiale che si ottiene variando la quota del piano focale (z).
 
 \begin{figure}[ht]
     \centering
     \includegraphics{images/radial_intensity.pdf}
-    \caption{Profilo di indensità radiale rispetto al centroide
+    \caption{Profilo di intensità radiale rispetto al centroide
     per una microsfera, in diversi piani }
     \label{fig:radial_itensity}
 \end{figure}
@@ -80,10 +84,10 @@ Da questi dati è stato possibile osservare che il rapporto tra
 l'intensità integrata in un anello centrato sulla microsfera e quella
 integrata nella regione interna al medesimo anello (regioni gialle
 e arancioni in figura), mostra un andamento proporzionale alla quota
-del piano focale, almeno in un certo intorno del centro della sfera.
+del piano focale in un certo intorno del centro della sfera.
 
 In figura \ref{fig:z_est} viene mostrato l'andamento del rapporto
-tra l'intensità media in un anello con raggio interno ed esterno
+tra l'intensità media in un anello con raggi interno ed esterno
 rispettivamente di \SIlist{80;160}{pixel} e l'intensità media
 calcolata in un raggio di \SI{60}{pixel}.
 
@@ -98,16 +102,17 @@ calcolata in un raggio di \SI{60}{pixel}.
 Come si può osservare la quantità così definita può essere usata
 per determinare la quota con una discreta sensibilità in
 un intervallo di \SIrange{3}{4}{\um} intorno al centro della sfera.
-Analogamente a quanto fatto per le assi x e y è possibile eseguire
+Analogamente a quanto fatto per gli assi x e y è possibile eseguire
 una calibrazione spostando il campione di una quota controllata
 attraverso il traslatore piezoelettrico dell'obiettivo, e costruire
 una curva di calibrazione come quella in figura \ref{fig:z_est}.
 
 Conoscendo quindi tre fattori di calibrazione è possibile, partendo
 da un'immagine della microsfera, ottenere una stima della sua
-posizione nello spazio tridimensionale. Questo fatto ci permette
+posizione nello spazio tridimensionale. Questo ci permette
 di implementare un sistema attivo di stabilizzazione meccanica del
-microscopio. Continuando a monitorare la sfera mediante mentre si
+microscopio. Continuando a monitorare la sfera, mediante l'illuminazione
+a luce trasmessa, mentre si
 eseguono le misurazioni di forza è possibile rilevare gli spostamenti
 del campione e compensarli inviando appositi comandi ai traslatori
 piezoelettrici.
@@ -122,18 +127,15 @@ attivata, il codice acquisice diverse immagini della microsfera e
 ne stima la posizione iniziale in termini di coordinate (x, y, z),
 usando i fattori di conversione determinati con la calibrazione.
 A questo punto viene avviato un ciclo di retroazione: continuando
-a acquisire immagini della microsfera (a una frequenza che può
+ad acquisire immagini della microsfera (a una frequenza che può
 arrivare fino a \SI{100}{\Hz}), viene comandato ai traslatori
 uno spostamento proporzionale alla differenza tra la posizione della
 sfera rilevata e quella iniziale.
 
 Quando il sistema di stabilizzazione meccanica viene attivato
 è stato possibile mostrare che la posizione media del campione resta
-stabile indipendentemente dal tempo di osservazione, con fluttuazione
+stabile indipendentemente dal tempo di osservazione, con fluttuazioni
 che hanno una deviazione standard di circa \SI{1}{\nm}.
-Introdurre nel ciclo di controlla alla componente proporzionale
-una componente integrale o derivativa non altera significativamente
-la stabilizzazione raggiunta.
 Il fattore di proporzionalità del ciclo di retroazione
 (guadagno, $g$) influenza
 le caratteristiche della risposta del sistema: un fattore troppo
@@ -158,9 +160,9 @@ del fattore di proporzionalità $g$.
 L'acquisizione di diverse tracce della durata di 5-10 minuti ha
 sempre mostrato deviazioni standard delle fluttuazioni comprese
 tra \SIlist{1;2}{\nm}.
-In figura \ref{fig:active_stab} vengono riporati i tracciati delle
+In figura \ref{fig:active_stab} vengono riportati i tracciati delle
 fluttuazioni della posizione del campione, con (nero) e senza
-(rosso) l'intervendo del sistema di stabilizzazione attiva.
+(rosso) l'intervento del sistema di stabilizzazione attiva.
 
 \begin{figure}[ht]
     \centering
@@ -171,13 +173,13 @@ fluttuazioni della posizione del campione, con (nero) e senza
 \end{figure}
 
  
- \section{Calibrazione parametri trappole}
+ \section{Calibrazione dei parametri delle trappole}
  \label{sec:calibration}
  
  Per poter eseguire misurazioni di forza su sistemi biologici è
  fondamentale riuscire a conoscere il valore della tensione applicata
- alle microsfere intrappolate nelle pinzette ottiche. Questo è
- possibile dal momento che l'azione di una pinzetta ottica su una
+ alle microsfere intrappolate nelle pinzette ottiche. Questo si può
+ effettuare poriché l'azione di una pinzetta ottica su una
  microsfera può essere modellizzata come una forza di richiamo
  elastica (vedi sezione \ref{sec:ot}).
  
@@ -188,7 +190,7 @@ fluttuazioni della posizione del campione, con (nero) e senza
  
  Quando la microsfera viene messa in movimento da una forza esterna,
  è necessario considerare anche l'attrito viscoso con
- il fluido in cui è immersa. La forza dovuto all'attrito viscoso
+ il fluido in cui è immersa. La forza dovuta all'attrito viscoso
  avrà la forma:
  \begin{equation}
      \vec{F}_{visc} = - \gamma \vec{v}\
@@ -197,7 +199,7 @@ fluttuazioni della posizione del campione, con (nero) e senza
  Dove $\gamma$ è il coefficiente di attrito idrodinamico della
  microsfera.
  
- Nel caso più generele la microsfera sarà inoltre soggetta a una
+ Nel caso più generale la microsfera sarà inoltre soggetta a una
  sforza stocastica ($\eta(t)$), dovuta agli urti con il fluido, e
  a una forza esterna $\vec{F}$, ad esempio dovuta alle tensione di una
  biomolecola legata ad essa.
@@ -648,15 +650,89 @@ prestazioni del sistema utilizziamo dei campioni in cui una distribuzione
 di Alexa 647 è immobilizzata sul vetrino coprioggetti (vedi appendice
 \ref{app:protocols}, protocollo \ref{proto:alexa}).
 
-
 \begin{figure}[ht]
     \centering
-    \includegraphics{images/alexa647.png}
-    \caption{Caption}
-    \label{fig:my_label}
+    \includegraphics[scale=0.8]{images/alexa647.png}
+    \caption{Cella di flusso con fluorofori immobilizzati sul vetrino coprioggetti (a sinistra) e campione di controllo senza fluorofori (a destra). Istogramma delle due
+    immagini (in basso).}
+    \label{fig:alexa647}
+\end{figure}
+
+Il contrasto medio tra i fluorofori è lo sfondo (media dell'intensità in una regione
+lontana dai fluorofori) è maggiore di 10.
+
+\begin{figure}
+    \centering
+    \includegraphics[scale=0.8]{images/snr.png}
+    \caption{Profilo di intensità della PSF di un fluoroforo.}
+    \label{fig:snr}
 \end{figure}
 
  \section{TIRF e illuminazione a modi di galleria}
  \label{sec:gallery_mode}
  
- 
+ Quando sono presenti fluorofori liberi in soluzione, per esempio nel caso
+ in cui si voglia studiare l'interazione delle due proteine sottoposte a
+ \textit{force-clamp} con una terza piccola molecola marcata,
+ il rapporto segnale-rumore si riduce drasticamente.
+ La fluorescenza fuori fuoco infatti farà aumentare il valore medio del rumore
+ di fondo, arrivando a nascondere il segnale dei singoli fluorofori sul
+ piano focale.
+ Come è stato introdotto in \ref{sec:fluo} è possibile migliorare il rapporto
+ segnale/rumore in questi casi sfruttando schemi di illuminazione che riducono
+ il volume di campione eccitato.
+ 
+ Nel nostro caso l'interesse sta non solo nel ridurre il volume di eccitazione,
+ ma concentrarlo in una regione di poche centinaia di \si{\nm} intorno al sito
+ di interazione tra le due proteine sottoposte a \textit{force-clamp}.
+ 
+ Grazie all'utilizzo dello specchio mobile sul percorso di eccitazione della
+ fluorescenza, e di un obiettivo TIRF, è possibile esplorare tramite questo
+ apparato due possibili scenari sperimentali per rilevare la fluorescenza
+ nei dintorni della regione del legame.
+ 
+ Il primo schema (figura \ref{fig:gallery_tirf}) fa leva sull'accoppiamento evanescente
+ tra l'onda elettromagnetica presente sulla superficie del vetrino (illuminazione
+ TIRF) e i modi di galleria della microsfera immobilizzata (che si comporta come
+ risuonatore ottico). In questo modo un fluoroforo che si viene a trovare molto
+ vicino alla microsfera potrà acquisire, sempre per accoppiamento evanescente, parte
+ della radiazione luminosa immagazzinata nei modi di galleria.
+ 
+Il secondo schema (figura \ref{fig:gallery_hilo}) sfrutta invece uno schema di
+illuminazione HILO nel quale la microsfera è raggiunta lateralmente dal fascio di
+eccitazione.
+In questo modo è possibile eccitare direttamente i fluorofori (senza dipendere
+dall'accoppiamento evanescente) quando questi non vengono messi in ombra dalla
+microsfera. Quando si trovano sul lato opposto una loro eccitazione potrebbe comunque
+essere resa possibile dalla luce diffusa attraverso la microsfera.
+Un possibile problema di questo schema riguarda la geometria imposta dalla disposizione
+degli elementi ottici: il fascio inclinato infatti raggiunge il campione dallo stesso
+lato delle trappole. In queste condizioni, specialmente all'aumentare della potenza del
+laser usato per la fluorescenza, potrebbe diventare significativo l'effetto della pressione
+di radiazione del fascio obliquo sulle microsfere intrappolate, variando la dinamica delle
+loro fluttuazioni e quindi influenzando la corretta esecuzione del \textit{force-clamp}.
+
+
+
+
+ 
+\begin{figure}[h]
+\centering
+   \begin{subfigure}{0.45\linewidth}
+   \centering
+   \includegraphics[width=\linewidth]{images/gallery_tirf.pdf}
+   \caption{}
+   \label{fig:gallery_tirf} 
+\end{subfigure}
+\hfill
+\begin{subfigure}[H]{0.45\linewidth}
+   \centering
+   \includegraphics[width=\linewidth]{images/gallery_hilo.pdf}
+   \caption{}
+   \label{fig:gallery_hilo}
+\end{subfigure}
+\centering
+\caption{Ipotesi di esperimenti con fluorescenza di singola molecola combinata a \textit{force-clamp} e schema di illuminazione
+TIRF (a) e HILO (b).}
+\label{fig:three_beads}
+\end{figure}