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@ -201,7 +201,7 @@ fluttuazioni della posizione del campione, con (nero) e senza
Nel caso più generale la microsfera sarà inoltre soggetta a una Nel caso più generale la microsfera sarà inoltre soggetta a una
sforza stocastica ($\eta(t)$), dovuta agli urti con il fluido, e sforza stocastica ($\eta(t)$), dovuta agli urti con il fluido, e
a una forza esterna $\vec{F}$, ad esempio dovuta alle tensione di una
a una forza esterna $\vec{F}$, ad esempio dovuta alla tensione di una
biomolecola legata ad essa. biomolecola legata ad essa.
Possiamo quindi scrivere la forma più generale dell'equazione di moto Possiamo quindi scrivere la forma più generale dell'equazione di moto
come: come:
@ -240,7 +240,7 @@ fluttuazioni della posizione del campione, con (nero) e senza
= \sigma_x^2 = k_B T / k = \sigma_x^2 = k_B T / k
\end{multline} \end{multline}
Oltre alla conoscenza di $k$ un altro valore importante da stimare
Oltre alla conoscenza di $k$, un altro valore importante da stimare
è il tempo di rilassamento $\tau$ del sistema, ovvero la scala è il tempo di rilassamento $\tau$ del sistema, ovvero la scala
temporale nella quale la microsfera si stabilizza nella nuova temporale nella quale la microsfera si stabilizza nella nuova
posizione di equilibrio a seguito di una variazione della forza $F$. posizione di equilibrio a seguito di una variazione della forza $F$.
@ -268,13 +268,13 @@ e la stabilizzazione nella nuova posizione di equilibrio può
essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto. essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto.
Il protocollo di calibrazione sviluppato consente, partendo Il protocollo di calibrazione sviluppato consente, partendo
dalle tracce temporali della posizione relativa della
microsfera un'asse spaziale, di determinare con precisione i
dal campionamento della posizione relativa della
microsfera lungo un'asse spaziale, di determinare con precisione i
valori di $\tau$, e quindi di $k$ per ogni posizione della valori di $\tau$, e quindi di $k$ per ogni posizione della
trappola. trappola.
Per fare questo si tiene contro che la densità spettrale
delle fluttuazioni di posizione è data da \cite{Gittes1998}:
Per fare questo si tiene conto che la densità spettrale
delle fluttuazioni della posizione è data da \cite{Gittes1998}:
\begin{equation} \begin{equation}
S_x(\nu) = \frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)} S_x(\nu) = \frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)}
@ -283,7 +283,7 @@ essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto.
Dove $\nu_c = 1 / (2\pi\tau) = k / 2\pi\gamma$ é Dove $\nu_c = 1 / (2\pi\tau) = k / 2\pi\gamma$ é
la frequenza di taglio, inversamente proporzionale al tempo la frequenza di taglio, inversamente proporzionale al tempo
di rilassamento. di rilassamento.
Da un semplice $fit$ della distribuzione spettrale di rumore
Da un semplice $fit$ della distribuzione spettrale del rumore
della posizione è possibile quindi estrarre il valore di k. della posizione è possibile quindi estrarre il valore di k.
Il segnale misurabile in uscita dagli amplificatori differenziali dei QPD è un segnale in tensione, Il segnale misurabile in uscita dagli amplificatori differenziali dei QPD è un segnale in tensione,
@ -291,7 +291,7 @@ essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto.
posizione relativa della microsfera. posizione relativa della microsfera.
Tramite il fit dei dati possiamo anche ottenere il fattore Tramite il fit dei dati possiamo anche ottenere il fattore
di conversione $\beta$ tale che $x_{rel}(V) = \beta V$. di conversione $\beta$ tale che $x_{rel}(V) = \beta V$.
La distribuzione spettrale di rumore, riscalata rispetto alla
La distribuzione spettrale del rumore, riscalata rispetto alla
variabile $V$ sarà quindi: variabile $V$ sarà quindi:
\begin{equation} \begin{equation}
S_V(\nu) = \frac{1}{\beta^2}\frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)} S_V(\nu) = \frac{1}{\beta^2}\frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)}
@ -303,16 +303,16 @@ cella di flusso contenente microsfere di polistirene (di diametro
Grazie a un'apposito programma sviluppato in ambiente LabVIEW Grazie a un'apposito programma sviluppato in ambiente LabVIEW
(\texttt{Force-Clamp Calibration}) è possibile acquisire in maniera (\texttt{Force-Clamp Calibration}) è possibile acquisire in maniera
automatizzata le tracce del segnale prodotto dai QPD per una griglia automatizzata le tracce del segnale prodotto dai QPD per una griglia
di posizioni delle trappole. Il codice si occupo di memorizzare
le tracce temporali per ogni posizione spostare la trappola modificando
di posizioni delle trappole. Il codice si occupa di memorizzare
le tracce temporali, e per ogni posizione, spostare la trappola modificando
la frequenza inviata agli AOM. la frequenza inviata agli AOM.
Le tracce temporali vengono acquisite per una durata di \SI{10}{\second} per ogni Le tracce temporali vengono acquisite per una durata di \SI{10}{\second} per ogni
posizione e una frequenza di campionamento di \SI{200}{kS/s}.
posizione e a una frequenza di campionamento di \SI{200}{kS/s}.
In seguito viene calcolata per ogni posizione di ciascuna In seguito viene calcolata per ogni posizione di ciascuna
trappola la distribuzione spettrale di rumore, utilizzando un algoritmo trappola la distribuzione spettrale di rumore, utilizzando un algoritmo
per la trasformata di Fourier veloce (\textit{Fast Fourier Transform}, FFT), per la trasformata di Fourier veloce (\textit{Fast Fourier Transform}, FFT),
con i seguenti parametri riportati in tabella \ref{tab:fft_par}.
con i parametri riportati in tabella \ref{tab:fft_par}.
\begin{table}[ht] \begin{table}[ht]
\centering \centering
@ -341,8 +341,8 @@ i valori di $\beta$ e $k$ imponendo i valori noti riportati in tabella \ref{tab:
Raggio della sfera & $R$ & \SI{450}{\nm} \\ Raggio della sfera & $R$ & \SI{450}{\nm} \\
Temperatura & $T$ & \SI{295}{\K} \\ Temperatura & $T$ & \SI{295}{\K} \\
Distanza sfera da superificie & $d$ & \SI{1}{\um} \\ Distanza sfera da superificie & $d$ & \SI{1}{\um} \\
Viscosità & $\eta$ & \SI{1e-3}{Pl} \\
Coefficiente attrido idrodinamico & $\gamma$ & $6 \pi \eta R \left(1+\frac{9R}{16d}\right)$\\
Viscosità & $\eta$ & \SI{1e-3}{\Pa\second} \\
Coefficiente attrito idrodinamico & $\gamma$ & $6 \pi \eta R \left(1+\frac{9R}{16d}\right)$\\
Frequenza minima & $\nu_\text{min}$ & \SI{15}{\Hz} \\ Frequenza minima & $\nu_\text{min}$ & \SI{15}{\Hz} \\
Frequenza massima & $\nu_\text{max}$ & \SI{50}{\kHz} \\ Frequenza massima & $\nu_\text{max}$ & \SI{50}{\kHz} \\
\bottomrule \bottomrule
@ -364,7 +364,7 @@ confrontata con la funzione teorica.
Dai valori di $k$ e $\beta$ estratti per tutte le posizioni di ciascuna Dai valori di $k$ e $\beta$ estratti per tutte le posizioni di ciascuna
trappola è possibile interpolare i valori per ogni possibile posizione trappola è possibile interpolare i valori per ogni possibile posizione
intermeda. Per fare questo si usano delle funzioni polinomiali di ordine 3,
intermedia. Per fare questo si usano delle funzioni polinomiali di ordine 3,
come mostrato in figura \ref{fig:trap_ccurves}. come mostrato in figura \ref{fig:trap_ccurves}.
\begin{figure}[htpb] \begin{figure}[htpb]
@ -378,10 +378,10 @@ come mostrato in figura \ref{fig:trap_ccurves}.
\label{sec:force-clamp} \label{sec:force-clamp}
Un esperimento di \textit{force-clamp} consiste nello studiare la Un esperimento di \textit{force-clamp} consiste nello studiare la
dinamica e della formazione e della rottura del legame tra due
dinamica della formazione e della rottura del legame tra due
molecole quando queste sono sottoposte a una determinata molecole quando queste sono sottoposte a una determinata
forza di trazione costante. forza di trazione costante.
Per poter applicare una tale forza attraverso una microsfera catturata
Per poter applicare una tale forza tramite una microsfera catturata
in una pinzetta ottica è stato implementato un sistema di retroazione in una pinzetta ottica è stato implementato un sistema di retroazione
tra la lettura della posizione relativa della microsfera nella tra la lettura della posizione relativa della microsfera nella
trappola (dai QPD) e la posizione della trappola nel campione (tramite trappola (dai QPD) e la posizione della trappola nel campione (tramite
@ -389,17 +389,22 @@ gli AOM).
Scelto un valore per la forza (F) si può ricavare, conoscendo il Scelto un valore per la forza (F) si può ricavare, conoscendo il
valore di $k$, il corrispondente spostamento $\Delta x$ rispetto al valore di $k$, il corrispondente spostamento $\Delta x$ rispetto al
centro della trappola. centro della trappola.
Comandando agli AOM uno spostamento della trappola proporzionale
alla differenza tra la posizione relativa attuale della microsfera
nella e quella necessaria per ottenere la forza $F$ possono
verificarsi due situazioni:
Per ottenere un valore forza applicata $F$ è necessario porsi
nella condizione in cui la microsfera si è spostata di $-k/F$ dalla
posizione di equilibrio.
Se definiamo questa posizione come $x_{SET}$ e avviamo un ciclo di
retroazione in cui
comandandiamo agli AOM uno spostamento della trappola proporzionale
alla differenza tra la posizione, rilevata dai QPD, della microsfera e
$x_{SET}$, possono verificarsi i due seguenti casi:
\begin{itemize} \begin{itemize}
\item Nel caso in cui la microsfera sia libera in soluzione, \item Nel caso in cui la microsfera sia libera in soluzione,
ovvero non vi sia applicata alcuna forza esterna, essa tenderà ovvero non vi sia applicata alcuna forza esterna, essa tenderà
a muoversi sempre verso il centro della trappola (la sua posizione a muoversi sempre verso il centro della trappola (la sua posizione
di equilibrio). Il sistema di retroazione quindi, per mantenere di equilibrio). Il sistema di retroazione quindi, per mantenere
la sfera in un punto di non equilibrio a distanza $\Delta x$ dalla la sfera in un punto di non equilibrio a distanza $\Delta x$ dalla
posizione di riposo dovrà continuare a muovere indefinitamente
posizione di riposo, dovrà continuare a muovere indefinitamente
la posizione della trappola nella stessa direzione. la posizione della trappola nella stessa direzione.
\item Nel caso in cui la microsfera si leghi a delle molecole \item Nel caso in cui la microsfera si leghi a delle molecole
immobilizzate sulla superficie del campione, lo spostamento delle immobilizzate sulla superficie del campione, lo spostamento delle
@ -437,14 +442,14 @@ di tipo FPGA (\textit{Field Programmable Gate Array}), per controllare
il ciclo di retroazione. il ciclo di retroazione.
In questo modo è possibile leggere i valori di posizione e aggiustare In questo modo è possibile leggere i valori di posizione e aggiustare
il segnale generato per gli AOM a una frequenza di \SI{200}{\kHz}, pari il segnale generato per gli AOM a una frequenza di \SI{200}{\kHz}, pari
al dobbio della larghezza di banda dei diodi usati nei QPD.
al doppio della larghezza di banda dei diodi usati nei QPD.
La scheda FPGA (National Instruments) è stata programmata con un codice La scheda FPGA (National Instruments) è stata programmata con un codice
progettato in ambiente LabVIEW, e comunica con un apposito programma progettato in ambiente LabVIEW, e comunica con un apposito programma
in esecuzione sul PC di controllo dell'esperimento per configurare i in esecuzione sul PC di controllo dell'esperimento per configurare i
parametri sperimentali e memorizzare i tracciati (\texttt{Force-Clamp Control}). parametri sperimentali e memorizzare i tracciati (\texttt{Force-Clamp Control}).
In figura \ref{fig:forceclamp-feedback} è mostrato una schema
In figura \ref{fig:forceclamp-feedback} è mostrato uno schema
semplificato del ciclo di retroazione implementato per ciascuna semplificato del ciclo di retroazione implementato per ciascuna
trappola. trappola.
@ -458,12 +463,15 @@ trappola.
\section{Saggio a tre sfere} \section{Saggio a tre sfere}
\label{sec:three-beads} \label{sec:three-beads}
Visto che nelle giunzioni aderenti la trasmissione degli sforzi
meccanici è spesso media tra proteine filamentose (come la
\textit{F-actina}) risulta particolarmente utile sviluppare un
saggio in cui, usando due trappole, è possibile mettere in tensione
una proteina filamentosa, simulando ad esempio lo stato in cui si
può trovare la \textit{F-actina} nel citoscheletro.
Nelle giunzioni aderenti la trasmissione degli sforzi
meccanici è spesso mediata da proteine filamentose (come la
\textit{F-actina}).
Per utilizzare questo tipo di proteine negli esperimenti di \textit{force-clamp}
risulta particolarmente utile sviluppare un tipo di misura in cui,
usando due trappole, è possibile mettere in tensione una proteina filamentosa,
legando le sue estremità a due microsfere intrappolate.
In questo modo possiamo fare interagire altre proteine. ad esempio immobilizzate
sul vetrino coprioggeti, con l'actina messa in tensione e sospesa tra le due trappole.
\begin{figure}[h] \begin{figure}[h]
\centering \centering
@ -494,12 +502,12 @@ trappole si muovono indefinitamente per ``inseguire'' la posizione
corrispondente alla forza richiesta. (c) Il filamento si lega con corrispondente alla forza richiesta. (c) Il filamento si lega con
una molecola immobilizzata sul vetrino, la microsfera raggiunge la una molecola immobilizzata sul vetrino, la microsfera raggiunge la
posizione target e lo spostamento delle trappole si arresta. La forza posizione target e lo spostamento delle trappole si arresta. La forza
applicata sul legame è pari a quella selezionata}.
applicata sul legame è pari a quella selezionata.}
\label{fig:three_beads} \label{fig:three_beads}
\end{figure} \end{figure}
In figura \ref{fig:three_beads} è rappresentato lo schema realizzato. In figura \ref{fig:three_beads} è rappresentato lo schema realizzato.
In mancanza di legame il sistema continuerebbe a muovere le trappole
In mancanza di legame, il sistema continuerebbe a muovere le trappole
indefinitamente fino a raggiungere regioni dove l'efficienza indefinitamente fino a raggiungere regioni dove l'efficienza
di intrappolamento non è più sufficiente oppure a esaurire l'intervallo di intrappolamento non è più sufficiente oppure a esaurire l'intervallo
di deflessioni ottenibili con gli AOM. di deflessioni ottenibili con gli AOM.
@ -508,7 +516,7 @@ delle trappole in un intervallo di qualche \si{nm}, implementando
un sistema di ``riflessione'': quando il fascio che sta tentando di un sistema di ``riflessione'': quando il fascio che sta tentando di
applicare la forza selezionata $\Delta F$ si è spostato di un determinato applicare la forza selezionata $\Delta F$ si è spostato di un determinato
cammino massimo, si scambia il ruolo delle due trappole e si applica cammino massimo, si scambia il ruolo delle due trappole e si applica
un comanda un incremento di forza $-\Delta F$ sulla trappola che prima
un incremento di forza $-\Delta F$ sulla trappola che prima
era passiva. In questo modo la tensione applicata sul sistema meccanico era passiva. In questo modo la tensione applicata sul sistema meccanico
è uguale in modulo e opposta in verso. Inoltre il sistema può continuare è uguale in modulo e opposta in verso. Inoltre il sistema può continuare
ad acquisire dati autonomamente per lunghi intervalli di tempo senza ad acquisire dati autonomamente per lunghi intervalli di tempo senza
@ -518,21 +526,21 @@ Uno schema di questo tipo è già stato utilizzato per lo studio
dell'interazione di motori molecolari (come la \textit{miosina}) e dell'interazione di motori molecolari (come la \textit{miosina}) e
filamenti di \textit{actina}. filamenti di \textit{actina}.
Nello studio delle giunzioni cellulari sono ipotizzabili numerosi Nello studio delle giunzioni cellulari sono ipotizzabili numerosi
esperimenti in cui l'interazione di uno o più fattori coinvolti
nel complesso delle adesioni sia fatti interagire con un filamento
esperimenti in cui uno o più fattori appartenenti ai complessi
di giunzione siano fatti interagire con un filamento
di actina teso tra le due trappole. di actina teso tra le due trappole.
\section{Fluorescenza di singola molecola.}
\section{Fluorescenza di singola molecola}
\label{sec:single_molecule_fluorescence} \label{sec:single_molecule_fluorescence}
L'apparato sperimentale consente, in parallelo all'esecuzione di L'apparato sperimentale consente, in parallelo all'esecuzione di
un esperimento di \textit{force-clamp}, di eccitare la fluorescenza un esperimento di \textit{force-clamp}, di eccitare la fluorescenza
del campione alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm}. del campione alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm}.
Anche il sistema di stabilizzazione attiva (che usa una Anche il sistema di stabilizzazione attiva (che usa una
transilluminazione a lunghezze d'onda $ >\SI{700}{\nm}$ può essere
transilluminazione a lunghezze d'onda $ >\SI{700}{\nm}$) può essere
mantenuto attivo contemporaneamente, visto che le finestra mantenuto attivo contemporaneamente, visto che le finestra
di eccitazione e emissione scelte sono a lunghezze d'onda inferiori.
di eccitazione ed emissione scelte sono a lunghezze d'onda inferiori.
I filtri dicroici utilizzati (vedi tabella \ref{tab:optical_components}) I filtri dicroici utilizzati (vedi tabella \ref{tab:optical_components})
permettono di osservare radiazione di fluorescenza emessa nelle permettono di osservare radiazione di fluorescenza emessa nelle
@ -549,8 +557,8 @@ finestre riportate in tabella \ref{tab:fluo_lambda}:
\num{635} & \numrange{663.0}{700.0} & \num{2.4} \\ \num{635} & \numrange{663.0}{700.0} & \num{2.4} \\
\bottomrule \bottomrule
\end{tabular} \end{tabular}
\caption{Lunghezze d'onda di eccitazione e emissione compatibili con l'apparato sperimentale, e potenza
elettromagnetica toatale immessa nel campo visivo.}
\caption{Lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione compatibili con l'apparato sperimentale, e potenza
elettromagnetica totale immessa nel campo visivo.}
\label{tab:fluo_lambda} \label{tab:fluo_lambda}
\end{table} \end{table}
@ -561,15 +569,15 @@ di impostare l'emissione di tutte le sorgenti laser in modo da avere sempre
$\SI{1}{\mW}$ di potenza ottica sul campione. $\SI{1}{\mW}$ di potenza ottica sul campione.
Per rendere uniforme la distribuzione di potenza nel campo visivo si tronca il Per rendere uniforme la distribuzione di potenza nel campo visivo si tronca il
fascio gaussiano prima di focalizzarlo sull'obiettivo a un raggio pari circa fascio gaussiano prima di focalizzarlo sull'obiettivo a un raggio pari circa
a 1/15 di quello iniziale (corrispondente a una regione sul campione pari al
campo visivo).
a 1/15 di quello iniziale (corrispondente alle dimensione del
campo visivo sul campione).
In questo modo le deviazione massima d'intensità tra i bordi e il centro In questo modo le deviazione massima d'intensità tra i bordi e il centro
della regione illuminata è ridotta al \SI{17}{\percent} (figura \ref{fig:flatfield}). della regione illuminata è ridotta al \SI{17}{\percent} (figura \ref{fig:flatfield}).
\begin{figure}[ht] \begin{figure}[ht]
\centering \centering
\includegraphics{images/flatfield.png} \includegraphics{images/flatfield.png}
\caption{Simulazione della distribuzione spaziale intensità \textit{laser} sul campione. Nell'inserto viene evidenziate la regione corrispondente al campo
\caption{Simulazione della distribuzione spaziale intensità \textit{laser} sul campione. Nell'inserto viene evidenziata la regione corrispondente al campo
visivo della telecamera di fluorescenza.} visivo della telecamera di fluorescenza.}
\label{fig:flatfield} \label{fig:flatfield}
\end{figure} \end{figure}


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