diff --git a/chapters/3-methods.tex b/chapters/3-methods.tex index e7d314b..c51d289 100644 --- a/chapters/3-methods.tex +++ b/chapters/3-methods.tex @@ -201,7 +201,7 @@ fluttuazioni della posizione del campione, con (nero) e senza Nel caso più generale la microsfera sarà inoltre soggetta a una sforza stocastica ($\eta(t)$), dovuta agli urti con il fluido, e - a una forza esterna $\vec{F}$, ad esempio dovuta alle tensione di una + a una forza esterna $\vec{F}$, ad esempio dovuta alla tensione di una biomolecola legata ad essa. Possiamo quindi scrivere la forma più generale dell'equazione di moto come: @@ -240,7 +240,7 @@ fluttuazioni della posizione del campione, con (nero) e senza = \sigma_x^2 = k_B T / k \end{multline} -Oltre alla conoscenza di $k$ un altro valore importante da stimare +Oltre alla conoscenza di $k$, un altro valore importante da stimare è il tempo di rilassamento $\tau$ del sistema, ovvero la scala temporale nella quale la microsfera si stabilizza nella nuova posizione di equilibrio a seguito di una variazione della forza $F$. @@ -268,13 +268,13 @@ e la stabilizzazione nella nuova posizione di equilibrio può essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto. Il protocollo di calibrazione sviluppato consente, partendo - dalle tracce temporali della posizione relativa della - microsfera un'asse spaziale, di determinare con precisione i + dal campionamento della posizione relativa della + microsfera lungo un'asse spaziale, di determinare con precisione i valori di $\tau$, e quindi di $k$ per ogni posizione della trappola. - Per fare questo si tiene contro che la densità spettrale - delle fluttuazioni di posizione è data da \cite{Gittes1998}: + Per fare questo si tiene conto che la densità spettrale + delle fluttuazioni della posizione è data da \cite{Gittes1998}: \begin{equation} S_x(\nu) = \frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)} @@ -283,7 +283,7 @@ essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto. Dove $\nu_c = 1 / (2\pi\tau) = k / 2\pi\gamma$ é la frequenza di taglio, inversamente proporzionale al tempo di rilassamento. - Da un semplice $fit$ della distribuzione spettrale di rumore + Da un semplice $fit$ della distribuzione spettrale del rumore della posizione è possibile quindi estrarre il valore di k. Il segnale misurabile in uscita dagli amplificatori differenziali dei QPD è un segnale in tensione, @@ -291,7 +291,7 @@ essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto. posizione relativa della microsfera. Tramite il fit dei dati possiamo anche ottenere il fattore di conversione $\beta$ tale che $x_{rel}(V) = \beta V$. - La distribuzione spettrale di rumore, riscalata rispetto alla + La distribuzione spettrale del rumore, riscalata rispetto alla variabile $V$ sarà quindi: \begin{equation} S_V(\nu) = \frac{1}{\beta^2}\frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)} @@ -303,16 +303,16 @@ cella di flusso contenente microsfere di polistirene (di diametro Grazie a un'apposito programma sviluppato in ambiente LabVIEW (\texttt{Force-Clamp Calibration}) è possibile acquisire in maniera automatizzata le tracce del segnale prodotto dai QPD per una griglia -di posizioni delle trappole. Il codice si occupo di memorizzare -le tracce temporali per ogni posizione spostare la trappola modificando +di posizioni delle trappole. Il codice si occupa di memorizzare +le tracce temporali, e per ogni posizione, spostare la trappola modificando la frequenza inviata agli AOM. Le tracce temporali vengono acquisite per una durata di \SI{10}{\second} per ogni -posizione e una frequenza di campionamento di \SI{200}{kS/s}. +posizione e a una frequenza di campionamento di \SI{200}{kS/s}. In seguito viene calcolata per ogni posizione di ciascuna trappola la distribuzione spettrale di rumore, utilizzando un algoritmo per la trasformata di Fourier veloce (\textit{Fast Fourier Transform}, FFT), -con i seguenti parametri riportati in tabella \ref{tab:fft_par}. +con i parametri riportati in tabella \ref{tab:fft_par}. \begin{table}[ht] \centering @@ -341,8 +341,8 @@ i valori di $\beta$ e $k$ imponendo i valori noti riportati in tabella \ref{tab: Raggio della sfera & $R$ & \SI{450}{\nm} \\ Temperatura & $T$ & \SI{295}{\K} \\ Distanza sfera da superificie & $d$ & \SI{1}{\um} \\ - Viscosità & $\eta$ & \SI{1e-3}{Pl} \\ - Coefficiente attrido idrodinamico & $\gamma$ & $6 \pi \eta R \left(1+\frac{9R}{16d}\right)$\\ + Viscosità & $\eta$ & \SI{1e-3}{\Pa\second} \\ + Coefficiente attrito idrodinamico & $\gamma$ & $6 \pi \eta R \left(1+\frac{9R}{16d}\right)$\\ Frequenza minima & $\nu_\text{min}$ & \SI{15}{\Hz} \\ Frequenza massima & $\nu_\text{max}$ & \SI{50}{\kHz} \\ \bottomrule @@ -364,7 +364,7 @@ confrontata con la funzione teorica. Dai valori di $k$ e $\beta$ estratti per tutte le posizioni di ciascuna trappola è possibile interpolare i valori per ogni possibile posizione -intermeda. Per fare questo si usano delle funzioni polinomiali di ordine 3, +intermedia. Per fare questo si usano delle funzioni polinomiali di ordine 3, come mostrato in figura \ref{fig:trap_ccurves}. \begin{figure}[htpb] @@ -378,10 +378,10 @@ come mostrato in figura \ref{fig:trap_ccurves}. \label{sec:force-clamp} Un esperimento di \textit{force-clamp} consiste nello studiare la -dinamica e della formazione e della rottura del legame tra due +dinamica della formazione e della rottura del legame tra due molecole quando queste sono sottoposte a una determinata forza di trazione costante. -Per poter applicare una tale forza attraverso una microsfera catturata +Per poter applicare una tale forza tramite una microsfera catturata in una pinzetta ottica è stato implementato un sistema di retroazione tra la lettura della posizione relativa della microsfera nella trappola (dai QPD) e la posizione della trappola nel campione (tramite @@ -389,17 +389,22 @@ gli AOM). Scelto un valore per la forza (F) si può ricavare, conoscendo il valore di $k$, il corrispondente spostamento $\Delta x$ rispetto al centro della trappola. -Comandando agli AOM uno spostamento della trappola proporzionale -alla differenza tra la posizione relativa attuale della microsfera -nella e quella necessaria per ottenere la forza $F$ possono -verificarsi due situazioni: +Per ottenere un valore forza applicata $F$ è necessario porsi +nella condizione in cui la microsfera si è spostata di $-k/F$ dalla +posizione di equilibrio. +Se definiamo questa posizione come $x_{SET}$ e avviamo un ciclo di +retroazione in cui +comandandiamo agli AOM uno spostamento della trappola proporzionale +alla differenza tra la posizione, rilevata dai QPD, della microsfera e +$x_{SET}$, possono verificarsi i due seguenti casi: + \begin{itemize} \item Nel caso in cui la microsfera sia libera in soluzione, ovvero non vi sia applicata alcuna forza esterna, essa tenderà a muoversi sempre verso il centro della trappola (la sua posizione di equilibrio). Il sistema di retroazione quindi, per mantenere la sfera in un punto di non equilibrio a distanza $\Delta x$ dalla - posizione di riposo dovrà continuare a muovere indefinitamente + posizione di riposo, dovrà continuare a muovere indefinitamente la posizione della trappola nella stessa direzione. \item Nel caso in cui la microsfera si leghi a delle molecole immobilizzate sulla superficie del campione, lo spostamento delle @@ -437,14 +442,14 @@ di tipo FPGA (\textit{Field Programmable Gate Array}), per controllare il ciclo di retroazione. In questo modo è possibile leggere i valori di posizione e aggiustare il segnale generato per gli AOM a una frequenza di \SI{200}{\kHz}, pari -al dobbio della larghezza di banda dei diodi usati nei QPD. +al doppio della larghezza di banda dei diodi usati nei QPD. La scheda FPGA (National Instruments) è stata programmata con un codice progettato in ambiente LabVIEW, e comunica con un apposito programma in esecuzione sul PC di controllo dell'esperimento per configurare i parametri sperimentali e memorizzare i tracciati (\texttt{Force-Clamp Control}). -In figura \ref{fig:forceclamp-feedback} è mostrato una schema +In figura \ref{fig:forceclamp-feedback} è mostrato uno schema semplificato del ciclo di retroazione implementato per ciascuna trappola. @@ -458,12 +463,15 @@ trappola. \section{Saggio a tre sfere} \label{sec:three-beads} -Visto che nelle giunzioni aderenti la trasmissione degli sforzi -meccanici è spesso media tra proteine filamentose (come la -\textit{F-actina}) risulta particolarmente utile sviluppare un -saggio in cui, usando due trappole, è possibile mettere in tensione -una proteina filamentosa, simulando ad esempio lo stato in cui si -può trovare la \textit{F-actina} nel citoscheletro. +Nelle giunzioni aderenti la trasmissione degli sforzi +meccanici è spesso mediata da proteine filamentose (come la +\textit{F-actina}). +Per utilizzare questo tipo di proteine negli esperimenti di \textit{force-clamp} +risulta particolarmente utile sviluppare un tipo di misura in cui, +usando due trappole, è possibile mettere in tensione una proteina filamentosa, +legando le sue estremità a due microsfere intrappolate. +In questo modo possiamo fare interagire altre proteine. ad esempio immobilizzate +sul vetrino coprioggeti, con l'actina messa in tensione e sospesa tra le due trappole. \begin{figure}[h] \centering @@ -494,12 +502,12 @@ trappole si muovono indefinitamente per ``inseguire'' la posizione corrispondente alla forza richiesta. (c) Il filamento si lega con una molecola immobilizzata sul vetrino, la microsfera raggiunge la posizione target e lo spostamento delle trappole si arresta. La forza -applicata sul legame è pari a quella selezionata}. +applicata sul legame è pari a quella selezionata.} \label{fig:three_beads} \end{figure} In figura \ref{fig:three_beads} è rappresentato lo schema realizzato. -In mancanza di legame il sistema continuerebbe a muovere le trappole +In mancanza di legame, il sistema continuerebbe a muovere le trappole indefinitamente fino a raggiungere regioni dove l'efficienza di intrappolamento non è più sufficiente oppure a esaurire l'intervallo di deflessioni ottenibili con gli AOM. @@ -508,7 +516,7 @@ delle trappole in un intervallo di qualche \si{nm}, implementando un sistema di ``riflessione'': quando il fascio che sta tentando di applicare la forza selezionata $\Delta F$ si è spostato di un determinato cammino massimo, si scambia il ruolo delle due trappole e si applica -un comanda un incremento di forza $-\Delta F$ sulla trappola che prima +un incremento di forza $-\Delta F$ sulla trappola che prima era passiva. In questo modo la tensione applicata sul sistema meccanico è uguale in modulo e opposta in verso. Inoltre il sistema può continuare ad acquisire dati autonomamente per lunghi intervalli di tempo senza @@ -518,21 +526,21 @@ Uno schema di questo tipo è già stato utilizzato per lo studio dell'interazione di motori molecolari (come la \textit{miosina}) e filamenti di \textit{actina}. Nello studio delle giunzioni cellulari sono ipotizzabili numerosi -esperimenti in cui l'interazione di uno o più fattori coinvolti -nel complesso delle adesioni sia fatti interagire con un filamento +esperimenti in cui uno o più fattori appartenenti ai complessi +di giunzione siano fatti interagire con un filamento di actina teso tra le due trappole. - \section{Fluorescenza di singola molecola.} + \section{Fluorescenza di singola molecola} \label{sec:single_molecule_fluorescence} L'apparato sperimentale consente, in parallelo all'esecuzione di un esperimento di \textit{force-clamp}, di eccitare la fluorescenza del campione alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm}. Anche il sistema di stabilizzazione attiva (che usa una -transilluminazione a lunghezze d'onda $ >\SI{700}{\nm}$ può essere +transilluminazione a lunghezze d'onda $ >\SI{700}{\nm}$) può essere mantenuto attivo contemporaneamente, visto che le finestra -di eccitazione e emissione scelte sono a lunghezze d'onda inferiori. +di eccitazione ed emissione scelte sono a lunghezze d'onda inferiori. I filtri dicroici utilizzati (vedi tabella \ref{tab:optical_components}) permettono di osservare radiazione di fluorescenza emessa nelle @@ -549,8 +557,8 @@ finestre riportate in tabella \ref{tab:fluo_lambda}: \num{635} & \numrange{663.0}{700.0} & \num{2.4} \\ \bottomrule \end{tabular} - \caption{Lunghezze d'onda di eccitazione e emissione compatibili con l'apparato sperimentale, e potenza - elettromagnetica toatale immessa nel campo visivo.} + \caption{Lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione compatibili con l'apparato sperimentale, e potenza + elettromagnetica totale immessa nel campo visivo.} \label{tab:fluo_lambda} \end{table} @@ -561,15 +569,15 @@ di impostare l'emissione di tutte le sorgenti laser in modo da avere sempre $\SI{1}{\mW}$ di potenza ottica sul campione. Per rendere uniforme la distribuzione di potenza nel campo visivo si tronca il fascio gaussiano prima di focalizzarlo sull'obiettivo a un raggio pari circa -a 1/15 di quello iniziale (corrispondente a una regione sul campione pari al -campo visivo). +a 1/15 di quello iniziale (corrispondente alle dimensione del +campo visivo sul campione). In questo modo le deviazione massima d'intensità tra i bordi e il centro della regione illuminata è ridotta al \SI{17}{\percent} (figura \ref{fig:flatfield}). \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics{images/flatfield.png} - \caption{Simulazione della distribuzione spaziale intensità \textit{laser} sul campione. Nell'inserto viene evidenziate la regione corrispondente al campo + \caption{Simulazione della distribuzione spaziale intensità \textit{laser} sul campione. Nell'inserto viene evidenziata la regione corrispondente al campo visivo della telecamera di fluorescenza.} \label{fig:flatfield} \end{figure}