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tesi-magistrale
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\chapter{Conclusione e prospettive future}\label{cap:results}
Nello svolgimento di questo lavoro di tesi è stata esplorata la possibilitàdi utilizzare tecniche di microscopia e manipolazione ottica avanzate eultraveloci per caratterizzare le proprietà meccaniche di complessi dibiomolecole interagenti.
Queste proprietà, in particolare la modulabilità delle proprietà dinamichedelle interazioni attraverso l'applicazione di stimoli meccanici controllati,sono alla base della \textit{meccanotrasduzione}, ovvero di ogni processoche consente la traduzione di un segnale di tipo meccanico in segnalibiochimici capaci di alterare il funzionamento di cellule e organismi.
Per decifrare i meccanismi fondamentali alla base della meccanotrasduzioneè stato considerato un approccio in cui un insieme minimo``funzionale'' di biomolecole viene isolato dal resto del rumoroso ambientecellulare, in modo da poter controllare con estrema precisione la posizionee il numero delle molecole interagenti, e da poter rilevare e caratterizzareanche interazioni transienti e di breve intensità, con tempi di vita mediainferiori al millisecondo.
La scelta di un approccio di questo tipo, se da una parte consentel'osservazione e la caratterizzazione di meccanismi di interazione altrimentiinvisibili, è però intrinsecamente limitata dalla necessità di porre ilsistema in condizioni molto diverse da quelle fisiologiche, in cui un numeroelevato di molecole diverse in natura è responsabile delle proprietàmeccaniche dei tessuti cellulari e della formazione e modulazione di segnalibiochimici.
Con questo lavoro di tesi si è voluto mostrare come questa limitazione siatecnicamente superabile andando ad accoppiare, a tecniche di spettroscopiadi forza già regolarmente utilizzate, schemi di microscopia di singolamolecola.Così facendo, infatti, è possibile aumentare il numero di molecole osservate nello stesso tempo: mentre l'interazione tra due molecole vienemonitorata accuratamente sotto condizioni meccaniche controllate,l'eventuale attivazione di cofattori terzi interagenti può essere rilevatagrazie alla microscopia di fluorescenza.
Correlando temporalmente queste due informazioni in un unico esperimento, èpossibile caratterizzare e quantificare un insieme di meccanismi fondamentaliper la meccanotrasduzione molto più ampio di quello esplorabile con ledue tecniche separatamente.
Per combinare efficacemente un sistema di spettroscopia di forzaultraveloce basato su pinzette ottiche con schemi di microscopia di singolamolecola è necessario confrontarsi con una serie di limitazioni sia dinatura ingegneristica che teorica.In particolare, è necessario evitare ogni possibile \textit{crosstalk} trale differenti modalità di acquisizione usate allo stesso tempo senza peròridurre la qualità, in termini di rapporto segnale/rumore,dei dati acquisiti.
Per questo motivo, anche se le tecniche di microscopia di singola molecolae di spettroscopia di forza risultano usate routinariamente da qualchetempo, non è stata ancora ancora sufficientemente esplorata la possibilitàdi un loro uso combinato in biofisica.
Con questo lavoro di tesi si è realizzato un apparato di misura in gradodi combinare la rilevazione in fluorescenza di singola molecola allaspettroscopia di forza \textit{force-clamp}, dimostrando la possibilitàdi ottenere misure di interazione con la stessa precisione e sensibilitàraggiungibili in un apparato di spettroscopia force-clamp isolato.
Inoltre, è stata esplorata la possibilità di sfruttare le proprietà ottichedei materiali usati negli esperimenti per incrementare il rapportosegnale/rumore in microscopia di fluorescenza. A questo riguardo, ulterioriapprofondimenti sulla possibilità di usare microsfere dielettriche comerisuonatori ottici si rendono necessari e potranno essere oggetto di uno studio futuro.
Un sistema sul quale può essere estremamente proficuo applicare questo tipodi misurazioni è quello delle giunzioni cellulari, in particolare quelle\textit{aderenti} o \textit{occludenti}, dove l'interazione tra diverse speciedi proteine è fondamentale per ottenere un ampia gamma di proprietà meccanicheosservabili nei tessuti viventi. In questi sistemi, nonostante la complessitàe varietà degli effetti macroscopici osservabili, è ancora possibileindividuare sottoinsiemi di specie di proteine sufficientemente limitati perpoter essere studiati con un metodo come quello descritto in questo lavoro.
Le giunzioni cellulari presentano ancora molti aspetti incompresi, soprattuttomanca ancora una accurata descrizione a livello molecolare dei meccanismidi interazione responsabili della meccanotrasduzione. Proprio per questomotivo rappresentano un ottimo banco di prova per l'applicazione dellemetodiche descritte.
Per quanto riguarda le \textit{giunzioni aderenti},l'osservazione diretta di come il legame tra le proteine \textit{vinculina}e $\alpha$\textit{-catenina} possa modulare l'interazione di quest'ultimacon i filamenti di \textit{actina} potrebbe permettere di determinare il ruolo,ancora non chiaro, della \textit{vinculina} nella regolazione delle proprietàdella giunzione. Una realizzazione sperimentale di questa misuraè possibile utilizzando l'apparato realizzato e marcando con una sondafluorescente la \textit{vinculina}, mentre allo stesso tempo la cineticadell'interazione actina-$\alpha$\textit{-catenina} viene registrata con il sistema di spettroscopia \textit{force-clamp} (figura \ref{fig:exp_aj}).
\begin{figure}[ht]    \centering    \includegraphics[width=0.6\linewidth]{images/exp_aj.pdf}    \caption{Ipotesi di esperimento per lo studio dell'interazione tra    alfa-catenina, actina e vinculina.}    \label{fig:exp_aj}\end{figure}
Analogamente, nel caso delle \textit{giunzioni occludenti}, il ruolo della proteina \textit{cingulina} nel regolare l'attività dellaproteina ZO-1, responsabile di connettere il dominio extra-cellulare dellagiunzione alle strutture di sostegno intra-cellulari, non è ancoracompletamente chiaro.In questo caso è possibile ipotizzare, sempre utilizzando l'apparatosperimentale realizzato, una misura in cui la cinetica dell'interazionetra la proteina ZO-1 (o di un frammento di essa) con filamenti di actinaviene registrata osservando, contemporaneamente, l'eventuale presenzadi cingulina marcata con sonde fluorescenti in prossimità della regionedi interazione (figura \ref{fig:exp_tj}).
\begin{figure}[ht]    \centering    \includegraphics[width=0.6\linewidth]{images/exp_tj.pdf}    \caption{Ipotesi di esperimento per lo studio dell'interazione tra    ZO-1, actina e cingulina.}    \label{fig:exp_tj}\end{figure}
In conclusione, si ritiene che l'approccio sperimentale descritto in questatesi abbia le caratteristiche necessarie per rispondere ai quesiti ancoraaperti sul funzionamento, a livello molecolare, di diversi meccanismidi \textit{meccanotrasduzione}, e possa fornire misure quantitative sulrapporto tra forze esterne applicate, cinetiche di interazione e regolazionedelle funzioni cellulari.