\chapter{Conclusione e prospettive future} \label{cap:results} Nello svolgimento di questo lavoro di tesi è stata esplorata la possibilità di utilizzare tecniche di microscopia e manipolazione ottica avanzate e ultraveloci per caratterizzare le proprietà meccaniche di complessi di biomolecole interagenti. Queste proprietà, in particolare la modulabilità delle proprietà dinamiche delle interazioni attraverso l'applicazione di stimoli meccanici controllati, sono alla base della \textit{meccanotrasduzione}, ovvero di ogni processo che consente la traduzione di un segnale di tipo meccanico in segnali biochimici capaci di alterare il funzionamento di cellule e organismi. Per decifrare i meccanismi fondamentali alla base della meccanotrasduzione è stato considerato un approccio in cui un insieme minimo ``funzionale'' di biomolecole viene isolato dal resto del rumoroso ambiente cellulare, in modo da poter controllare con estrema precisione la posizione e il numero delle molecole interagenti, e da poter rilevare e caratterizzare anche interazioni transienti e di breve intensità, con tempi di vita media inferiori al millisecondo. La scelta di un approccio di questo tipo, se da una parte consente l'osservazione e la caratterizzazione di meccanismi di interazione altrimenti invisibili, è però intrinsecamente limitata dalla necessità di porre il sistema in condizioni molto diverse da quelle fisiologiche, in cui un numero elevato di molecole diverse in natura è responsabile delle proprietà meccaniche dei tessuti cellulari e della formazione e modulazione di segnali biochimici. Con questo lavoro di tesi si è voluto mostrare come questa limitazione sia tecnicamente superabile andando ad accoppiare, a tecniche di spettroscopia di forza già regolarmente utilizzate, schemi di microscopia di singola molecola. Così facendo, infatti, è possibile aumentare il numero di molecole osservate nello stesso tempo: mentre l'interazione tra due molecole viene monitorata accuratamente sotto condizioni meccaniche controllate, l'eventuale attivazione di cofattori terzi interagenti può essere rilevata grazie alla microscopia di fluorescenza. Correlando temporalmente queste due informazioni in un unico esperimento, è possibile caratterizzare e quantificare un insieme di meccanismi fondamentali per la meccanotrasduzione molto più ampio di quello esplorabile con le due tecniche separatamente. Per combinare efficacemente un sistema di spettroscopia di forza ultraveloce basato su pinzette ottiche con schemi di microscopia di singola molecola è necessario confrontarsi con una serie di limitazioni sia di natura ingegneristica che teorica. In particolare, è necessario evitare ogni possibile \textit{crosstalk} tra le differenti modalità di acquisizione usate allo stesso tempo senza però ridurre la qualità, in termini di rapporto segnale/rumore, dei dati acquisiti. Per questo motivo, anche se le tecniche di microscopia di singola molecola e di spettroscopia di forza risultano usate routinariamente da qualche tempo, non è stata ancora ancora sufficientemente esplorata la possibilità di un loro uso combinato in biofisica. Con questo lavoro di tesi si è realizzato un apparato di misura in grado di combinare la rilevazione in fluorescenza di singola molecola alla spettroscopia di forza \textit{force-clamp}, dimostrando la possibilità di ottenere misure di interazione con la stessa precisione e sensibilità raggiungibili in un apparato di spettroscopia force-clamp isolato. Inoltre, è stata esplorata la possibilità di sfruttare le proprietà ottiche dei materiali usati negli esperimenti per incrementare il rapporto segnale/rumore in microscopia di fluorescenza. A questo riguardo, ulteriori approfondimenti sulla possibilità di usare microsfere dielettriche come risuonatori ottici si rendono necessari e potranno essere oggetto di uno studio futuro. Un sistema sul quale può essere estremamente proficuo applicare questo tipo di misurazioni è quello delle giunzioni cellulari, in particolare quelle \textit{aderenti} o \textit{occludenti}, dove l'interazione tra diverse specie di proteine è fondamentale per ottenere un ampia gamma di proprietà meccaniche osservabili nei tessuti viventi. In questi sistemi, nonostante la complessità e varietà degli effetti macroscopici osservabili, è ancora possibile individuare sottoinsiemi di specie di proteine sufficientemente limitati per poter essere studiati con un metodo come quello descritto in questo lavoro. Le giunzioni cellulari presentano ancora molti aspetti incompresi, soprattutto manca ancora una accurata descrizione a livello molecolare dei meccanismi di interazione responsabili della meccanotrasduzione. Proprio per questo motivo rappresentano un ottimo banco di prova per l'applicazione delle metodiche descritte. Per quanto riguarda le \textit{giunzioni aderenti}, l'osservazione diretta di come il legame tra le proteine \textit{vinculina} e $\alpha$\textit{-catenina} possa modulare l'interazione di quest'ultima con i filamenti di \textit{actina} potrebbe permettere di determinare il ruolo, ancora non chiaro, della \textit{vinculina} nella regolazione delle proprietà della giunzione. Una realizzazione sperimentale di questa misura è possibile utilizzando l'apparato realizzato e marcando con una sonda fluorescente la \textit{vinculina}, mentre allo stesso tempo la cinetica dell'interazione actina-$\alpha$\textit{-catenina} viene registrata con il sistema di spettroscopia \textit{force-clamp} (figura \ref{fig:exp_aj}). \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=0.6\linewidth]{images/exp_aj.pdf} \caption{Ipotesi di esperimento per lo studio dell'interazione tra alfa-catenina, actina e vinculina.} \label{fig:exp_aj} \end{figure} Analogamente, nel caso delle \textit{giunzioni occludenti}, il ruolo della proteina \textit{cingulina} nel regolare l'attività della proteina ZO-1, responsabile di connettere il dominio extra-cellulare della giunzione alle strutture di sostegno intra-cellulari, non è ancora completamente chiaro. In questo caso è possibile ipotizzare, sempre utilizzando l'apparato sperimentale realizzato, una misura in cui la cinetica dell'interazione tra la proteina ZO-1 (o di un frammento di essa) con filamenti di actina viene registrata osservando, contemporaneamente, l'eventuale presenza di cingulina marcata con sonde fluorescenti in prossimità della regione di interazione (figura \ref{fig:exp_tj}). \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=0.6\linewidth]{images/exp_tj.pdf} \caption{Ipotesi di esperimento per lo studio dell'interazione tra ZO-1, actina e cingulina.} \label{fig:exp_tj} \end{figure} In conclusione, si ritiene che l'approccio sperimentale descritto in questa tesi abbia le caratteristiche necessarie per rispondere ai quesiti ancora aperti sul funzionamento, a livello molecolare, di diversi meccanismi di \textit{meccanotrasduzione}, e possa fornire misure quantitative sul rapporto tra forze esterne applicate, cinetiche di interazione e regolazione delle funzioni cellulari.