ortograf + bib + proto

chapters/1-introduction.tex

@@ -846,7 +846,7 @@ di applicazione della microscopia TIRF. Quando è necessario
 individuare fluorofori che si trovano a una profondità maggiore
 di poche centinaia di nanometri rispetto al vetrino coprioggetti
 questa tecnica non è più utilizzabile. Inoltre, come recentemente
-evidenziato \cite{}, esistono limiti che mettono in discussione
+evidenziato \cite{Oheim2019}, esistono limiti che mettono in discussione
 l'applicabilità dell'equazione \ref{eq:depth} in situazioni reali;
 questa infatti non tiene conto di alcuni fattori, come la
 - seppur piccola - divergenza del fascio laser gaussiano, che non

chapters/2-setup.tex

@@ -589,13 +589,13 @@ eccitazione in uscita dall'obiettivo.
             & \\
         DIC-Fluor
             & Filtro dicroico quad-edge
-            & Separazione eccitazione/emissione
+            & Separaz. ecc./emiss.
             & $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$
             & Di03-R405/488/532/635-t1 \\
     \multicolumn{5}{l}{\it Percorso trappole}\\
         L-TS4a
             & Lente sferica piano-convessa
-            & Inserimento laser 1064nm in isolatore.
+            & Inser. 1064nm in isolatore.
             & %f: \SI{0}{\mm}
             & \\
         L-TS4b
@@ -638,7 +638,7 @@ eccitazione in uscita dall'obiettivo.
             & \\
         DIC-BF
             & Filtro dicroico single-edge
-            & Seprazione fluorescenza/brightfied
+            & Sep. fluor/bf
             & $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$
             & FF705-Di01-25x36\\
         F-BlockBF
@@ -648,12 +648,12 @@ eccitazione in uscita dall'obiettivo.
             & FESH0700\\
         F-Emiss
             & Filtro passa-banda quad-band
-            & Fluorofori/Soppressione laser eccitazione
+            & Fluor/Soppr. laser ecc.
             & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$
             & FF01-446/510/581/703\\
         F-BlockTwz
             & Filtro band-stop
-            & Soppressione laser trappole residuo
+            & Soppressione laser 1064
             & $\lambda_{centr}: 1064nm$
             & \\
      \end{tabular}

chapters/3-methods.tex

@@ -333,12 +333,12 @@ essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto.
 Per la calibrazione si procede a preparare un campione con una
 cella di flusso contenente microsfere di polistirene (di diametro
 \SI{0.9}{\um}).
-Grazie a un'apposito programma sviluppato in ambiente LabVIEW
+Grazie a un apposito programma sviluppato in ambiente LabVIEW
 (\texttt{Force-Clamp Calibration}) è possibile acquisire in maniera
 automatizzata le tracce del segnale prodotto dai QPD per una griglia
 di posizioni delle trappole. Il codice si occupa di memorizzare
 le tracce temporali, e per ogni posizione, spostare la trappola modificando
-la frequenza inviata agli AOM.
+la frequenza inviata agli AOD.
 
 Le tracce temporali vengono acquisite per una durata di \SI{10}{\second} per ogni
 posizione e a una frequenza di campionamento di \SI{200}{kS/s}.

chapters/A2-electronics.tex

@@ -2,7 +2,7 @@
 \label{app:electronics}
 
 Il sistema elettronico che consente di applicare il ciclo di retroazione
-tra la posizione rilevate della microsfera nelle trappole e la posizione di
+tra le posizioni rilevate delle microsfere nelle trappole e le posizioni di
 queste ultime nel campione è reso particolarmente complesso dalla necessità
 di operare le correzioni in un tempo estremamente breve, per raggiungere un tempo
 di reazione significativamente inferiore al tempo di rilassamento diffusivo
@@ -20,7 +20,7 @@ Questi possono essere configurati, in fase di programmazione della scheda,
 per eseguire determinate funzioni logiche.
 Una volta programmata, la scheda è in grado di eseguire le funzioni logiche
 impostate e elaborare segnali proveniente dall'esterno attraverso dei \textit{pin} di input.
-Il risultato dell'elaborazione può essere immagazzinati in appositi registri
+Il risultato dell'elaborazione può essere immagazzinato in appositi registri
 (code) e letto su richiesta (ad esempio di un computer esterno), oppure
 utilizzato per comandare dei \textit{pin} di output presenti sulla scheda.
 
@@ -29,11 +29,11 @@ le componenti del circuito logico richiesto e quindi configurare i blocchi
 della scheda per \textit{realizzare} le funzioni del circuito integrato
 disegnato.
 
-Uno dei principali vantaggi dell'uso di schede FPGA sta nel fatto che il tempo
-di esecuzione delle singole operazioni è deterministico e riproducibile tra una
-iterazione e all'altra, a differenza di quanto accade nei PC dove l'accesso
-di ogni applicazione ai cicli di processore viene controllato da priorità
-e schedulatori del sistema operativo.
+Uno dei principali vantaggi dell'uso di schede FPGA sta nel fatto che
+il tempo di esecuzione delle singole operazioni è deterministico e
+riproducibile tra iterazioni successive, a differenza di quanto accade
+nei PC dove l'accesso di ogni applicazione ai cicli di processore
+viene controllato da priorità e schedulatori del sistema operativo.
 
 Per gli scopi di questa tesi è stata programmata una scheda FPGA per leggere
 i valori dei fotodiodi a quadrante (da cui si può estrapolare la posizione
@@ -41,18 +41,19 @@ relativa delle microsfere rispetto al centro della trappola) e controllare
 l'angolo di deflessione dei laser delle trappole (e quindi la loro posizione
 nel campione).
 
-Per ottenere questo risultato è stata scelta una scheda prodotta FPGA prodotta
-da National Instrument (USB-7855), programmabile attraverso interfaccia USB,
-dotata di 48 canali digitali configurabili come output o input e 8 convertitori
-analogico-digitali (ADC) integrati.
+Per ottenere questo risultato è stata scelta una scheda FPGA prodotta
+da National Instrument (USB-7855), programmabile attraverso
+interfaccia USB, dotata di 48 canali digitali configurabili come
+output o input e 8 convertitori analogico-digitali (ADC) integrati.
 
-La logica di funzionamento è stata definita utilizzando l'ambiente di sviluppo
-LabVIEW FPGA: questo permette di disegnare sotto forma di diagramma a blocchi
-la sequenza di funzioni da applicare sui dati ingresso.
-A partire da questo diagramma LabVIEW FPGA è in grado di generare il circuito
-logico necessario e descriverlo (secondo le specifiche del linguaggio VHDL).
-Un ulteriore passaggio converte il codice VHDL in istruzioni di programmazione
-della scheda, che vengono eseguite attraverso la connessione USB.
+La logica di funzionamento è stata definita utilizzando l'ambiente di
+sviluppo LabVIEW FPGA: questo permette di disegnare sotto forma di
+diagramma a blocchi la sequenza di funzioni da applicare sui dati in
+ingresso.  A partire da questo diagramma LabVIEW FPGA è in grado di
+generare il circuito logico necessario e descriverlo (secondo le
+specifiche del linguaggio VHDL).  Un ulteriore passaggio converte il
+codice VHDL in istruzioni di programmazione della scheda, che vengono
+eseguite attraverso la connessione USB.
 
 \begin{figure}[ht]
     \centering
@@ -69,7 +70,7 @@ collegata direttamente ai convertitori analogico/digitali dell'FPGA.
 La differenza tra il segnale misurato in ingresso e il set-point viene
 trasformata, attraverso un fattore di conversione determinato in fase di
 calibrazione, in una variazione della frequenza del segnale elettronico
-inviato ai trasduttori presenti sui modulatori acusto ottici.
+inviato ai trasduttori presenti sui deflettori acusto ottici.
 
 La generazione del segnale elettronico alla frequenza richiesta è
 delegata a due generatori digitali di segnale (DDS, Direct Digital
@@ -102,18 +103,19 @@ e ha richiesto un'analisi precisa del segnale trasportato su ciascun
 conduttore del bus tra FPGA e DDS.
 In ultima analisi si è rilevato come fenomeni di \textit{diafonia} tra
 i vari conduttori presenti sul cavo utilizzato per connettore l'FPGA ai DDS
-(cavo fornito da National Instrument) portino ad un allungamento del 
+(cavo fornito da National Instrument) portino ad un allungamento del
 transiente necessario affinché tutti i bit del bus raggiungano il valore
 impostato.
 
 Si è quindi dovuto procedere a rallentare la velocità di scrittura
 delle singole \textit{word} sui DDS, inserendo un piccolo tempo morto
-(nell'ordine dei nanosecondi) tra la scrittura della word e il trasferimento
-nel registro di memoria.
+(nell'ordine dei nanosecondi) tra la scrittura della \textit{word} e
+il trasferimento nel registro di memoria.
 
-In conclusione si è osservata una completa risoluzione dei problemi osservati
-con una variazione dei tempi di reazione del sistema ampiamente trascurabile
-rispetto al limiti dettati dal rate di campionamento del segnale dei QPD.
+In conclusione si è osservata una completa risoluzione dei problemi
+osservati con una variazione dei tempi di reazione del sistema
+ampiamente trascurabile rispetto al limiti dettati dal rate di
+campionamento del segnale dei QPD.
 
 
 

chapters/A3-protocols.tex

@@ -60,7 +60,7 @@ immobilizzate}
     contenente microsfere
         e nitrocellulosa, in modo da eliminare eventuali aggregati.
     \STATE Vortexare per \SIrange{20}{30}{\second}, in modo da sospendere
-        omogenemaente le microsfere nel volume della soluzione.
+        omogeneamente le microsfere nel volume della soluzione.
     \STATE Prelevare con una micropipetta \SIrange{1}{2}{\uL} di soluzione.
     \STATE Depositare la soluzione sopra un vetrino coprioggetti, tenendolo
         fermo con la punta della pipetta e utilizzando un secondo vetrino per
@@ -81,17 +81,22 @@ immobilizzate}
     \centering
     \includegraphics{images/flow_cell.pdf}
     \caption{Realizzazione di una cella di flusso}
-    \label{fig:my_label}
+    \label{fig:flow_cell}
 \end{figure}
 
 
 \begin{algorithm}[ht]
 \caption{Cella di flusso con fluoroforo immobilizzato}
-\label{proto:silica_beads_flow_cell}
+\label{proto:alexa}
 \begin{tabular}{p{2cm} p{12cm}}
      \textbf{Materiale \mbox{necessario}:}
      & 
-         $\bullet$~Soluzione con fluoroforo streptavidinato
+         $\bullet$~Soluzione con fluoroforo streptavidinato (Alexa Fluor)
+         $\bullet$~Soluzione con microsfere in nitrocellulosa
+     (vedi Protocollo \ref{proto:silica_beads})
+     $\bullet$-Soluzione di albumina sierica bovina (BSA) biotilinata
+     $\bullet$-Buffer AB (100mM Tris-\ce{HCl}, 20mM \ce{MgCl2}, 500mM \ce{KCl}, 50mM carbonato guanidina, pH 7.5)
+     $\bullet$-Imaging Buffer (buffer AB addizionato con 1.2 \si{\micro M} glucosio ossidasi [Sigma G7141], 0.2 \si{\micro M} catalasi [Sigma C40], 17 mM glucosio, 20 mM DTT)
          $\bullet$~Acqua ultrapura Milli-Q\textsuperscript{®}
          $\bullet$~Vetrino portaoggetti
          $\bullet$~Vetrini coprioggetti \#0 (spessore \SI{100}{\um}) 
@@ -101,31 +106,13 @@ immobilizzate}
          $\bullet$~Carta assorbente
 \end{tabular}
 \begin{algorithmic}[1]
-    \STATE Pulire accuratamente un vetrino portaoggetti e due vetrini
-        coprioggetti, risciacquandoli con etanolo su entrambi i lati.
-    \STATE Far evaporare completamente il solvente.
-    \STATE Ritagliare delle strisce sottili e lunghe (circa
-        \SIlist{2x50}{\mm}) di foglio biadesivo.
-    \STATE Preparare le celle di flusso sul vetrino coprioggetti utilizzando
-        le striscette adesive (come in figura), lasciando la pellicola
-        protettiva superiore.
-    \STATE Sonicare per \SIrange{1}{2}{\minute} minuti la soluzione
-    contenente microsfere
-        e nitrocellulosa, in modo da eliminare eventuali aggregati.
-    \STATE Vortexare per \SIrange{20}{30}{\second}, in modo da sospendere
-        omogenemaente le microsfere nel volume della soluzione.
-    \STATE Prelevare con una micropipetta \SIrange{1}{2}{\uL} di soluzione.
-    \STATE Depositare la soluzione sopra un vetrino coprioggetti, tenendolo
-        fermo con la punta della pipetta e utilizzando un secondo vetrino per
-        stendere uniformemente la soluzione, poi lasciare riposare \SI{5}{\minute}.
-    \STATE Rimuovere le pellicole protettive dagli adesivi sul vetrino
-        coprioggetti, creare le celle di flusso chiudendo il vetrino
-        coprioggetti sul vetrino portaoggetti, assicurandosi che la superficie
-        rivestita con la soluzione rimanga interna alla cella.
-    \STATE Immettere acqua ultrapura, utilizzando una micropipetta, da un lato
-        della cella di flusso, fino a riempirla completamente. Utilizzare se
-        necessario un pezzo di carta assorbente per agevolare il flusso
-        dell'acqua attraverso la cella.
+  \STATE Preparare una cella di flusso con microsfere in nitrocellulosa
+  immobilizzate come descritto nel protocollo \ref{proto:silica_beads_flow_cell}
+  \STATE Immettere, da un lato della cella di flusso, un volume di soluzione di BSA biotilinata e,
+  una volta riempita la cella, incubare 2/3 minuti.
+    \STATE Immettere nella cella di flusso un volume di soluzione di fluoroforo streptavidinato, una volta riempita la cella incubare per 4 minuti.
+    \STATE Lavare la cella con 4-5 volumi di Buffer AB
+    \STATE Immettere nella cella un volume di Imaging Buffer.
     \STATE Sigillare i lati aperti della cella utilizzando del silicone.
 \end{algorithmic}
-\end{algorithm}
+\end{algorithm}

references.bib

@@ -203,4 +203,18 @@
   author = {P. Welch},
   title = {The use of fast Fourier transform for the estimation of power spectra: A method based on time averaging over short,  modified periodograms},
   journal = {{IEEE} Transactions on Audio and Electroacoustics}
+}
+
+@article{Oheim2019,
+  doi = {10.1016/j.bpj.2019.07.048},
+  _url = {https://doi.org/10.1016/j.bpj.2019.07.048},
+  year = {2019},
+  month = sep,
+  publisher = {Elsevier {BV}},
+  volume = {117},
+  number = {5},
+  pages = {795--809},
+  author = {Martin Oheim and Adi Salomon and Adam Weissman and Maia Brunstein and Ute Becherer},
+  title = {Calibrating Evanescent-Wave Penetration Depths for Biological {TIRF} Microscopy},
+  journal = {Biophysical Journal}
 }