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118 lines
5.6 KiB
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\chapter{Protocolli}
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\label{app:protocols}
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\begin{algorithm}[ht]
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\caption{Microsfere di silice in nitrocellulosa \cite{Monico2014}}
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\label{proto:silica_beads}
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\begin{tabular}{p{2cm} p{12cm}}
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\textbf{Materiale \mbox{necessario}:}
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&
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$\bullet$~Foglio di nitrocellulosa
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$\bullet$~Microsfere in silice (diametro \SI{1.54}{\um},
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10\% fraz. solida)
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$\bullet$~Acetato di pentile
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$\bullet$~Provette
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$\bullet$~Centrifuga da banco
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$\bullet$~Acetone
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\end{tabular}
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\begin{algorithmic}[1]
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\STATE Preparare \SI{1}{\mL} di soluzione di nitrocellulosa
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dissolta in acetato di pentile, concentrazione \SI{0.1}{\percent}.
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\STATE Diluire \SI{20}{\uL} di microsfere in silice in
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\SI{1}{\mL} di acetone, sonicare per \SI{30}{\second} e
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vortexare.
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\STATE Centrifugare per \SI{2}{\minute} a \SI{19000}{g}.
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\STATE Ripetere il lavaggio precedente sempre con \SI{1}{\mL} di acetone.
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\STATE Ripetere il lavaggio precedente due volte con acetato di
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pentile.
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\STATE Risospendere infine nella soluzione di nitrocellulosa in acetato di pentile (\SI{0.1}{\percent}).
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\STATE Conservare a \SI{4}{\celsius} e usare entro un mese.
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\end{algorithmic}
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\end{algorithm}
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\begin{algorithm}[ht]
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\caption{Cella di flusso con microsfere in silice
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immobilizzate}
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\label{proto:silica_beads_flow_cell}
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\begin{tabular}{p{2cm} p{12cm}}
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\textbf{Materiale \mbox{necessario}:}
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&
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$\bullet$~Soluzione con microsfere in nitrocellulosa
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(vedi Protocollo \ref{proto:silica_beads})
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$\bullet$~Acqua ultrapura Milli-Q\textsuperscript{®}
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$\bullet$~Vetrino portaoggetti
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$\bullet$~Vetrini coprioggetti \#0 (spessore \SI{100}{\um})
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$\bullet$~Foglio biadesivo (spessore $\approx \SI{60}{\um}$)
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$\bullet$~Etanolo assoluto ($> 99.8\%$)
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$\bullet$~Silicone
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$\bullet$~Carta assorbente
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\end{tabular}
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\begin{algorithmic}[1]
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\STATE Pulire accuratamente un vetrino portaoggetti e due vetrini
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coprioggetti, risciacquandoli con etanolo su entrambi i lati.
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\STATE Far evaporare completamente il solvente.
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\STATE Ritagliare delle strisce sottili e lunghe (circa
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\SIlist{2x50}{\mm}) di foglio biadesivo.
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\STATE Preparare le celle di flusso sul vetrino coprioggetti utilizzando
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le striscette adesive (come in figura), lasciando la pellicola
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protettiva superiore.
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\STATE Sonicare per \SIrange{1}{2}{\minute} minuti la soluzione
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contenente microsfere
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e nitrocellulosa, in modo da eliminare eventuali aggregati.
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\STATE Vortexare per \SIrange{20}{30}{\second}, in modo da sospendere
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omogeneamente le microsfere nel volume della soluzione.
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\STATE Prelevare con una micropipetta \SIrange{1}{2}{\uL} di soluzione.
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\STATE Depositare la soluzione sopra un vetrino coprioggetti, tenendolo
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fermo con la punta della pipetta e utilizzando un secondo vetrino per
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stendere uniformemente la soluzione, poi lasciare riposare \SI{5}{\minute}.
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\STATE Rimuovere le pellicole protettive dagli adesivi sul vetrino
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coprioggetti, creare le celle di flusso chiudendo il vetrino
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coprioggetti sul vetrino portaoggetti, assicurandosi che la superficie
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rivestita con la soluzione rimanga interna alla cella.
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\STATE Immettere acqua ultrapura, utilizzando una micropipetta, da un lato
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della cella di flusso, fino a riempirla completamente. Utilizzare se
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necessario un pezzo di carta assorbente per agevolare il flusso
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dell'acqua attraverso la cella.
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\STATE Sigillare i lati aperti della cella utilizzando del silicone.
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\end{algorithmic}
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\end{algorithm}
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\begin{figure}[H]
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\centering
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\includegraphics{images/flow_cell.pdf}
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\caption{Realizzazione di una cella di flusso}
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\label{fig:flow_cell}
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\end{figure}
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\begin{algorithm}[ht]
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\caption{Cella di flusso con fluoroforo immobilizzato}
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\label{proto:alexa}
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\begin{tabular}{p{2cm} p{12cm}}
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\textbf{Materiale \mbox{necessario}:}
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&
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$\bullet$~Soluzione con fluoroforo streptavidinato (Alexa Fluor)
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$\bullet$~Soluzione con microsfere in nitrocellulosa
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(vedi Protocollo \ref{proto:silica_beads})
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$\bullet$-Soluzione di albumina sierica bovina (BSA) biotilinata
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$\bullet$-Buffer AB (100mM Tris-\ce{HCl}, 20mM \ce{MgCl2}, 500mM \ce{KCl}, 50mM carbonato guanidina, pH 7.5)
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$\bullet$-Imaging Buffer (buffer AB addizionato con 1.2 \si{\micro M} glucosio ossidasi [Sigma G7141], 0.2 \si{\micro M} catalasi [Sigma C40], 17 mM glucosio, 20 mM DTT)
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$\bullet$~Acqua ultrapura Milli-Q\textsuperscript{®}
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$\bullet$~Vetrino portaoggetti
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$\bullet$~Vetrini coprioggetti \#0 (spessore \SI{100}{\um})
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$\bullet$~Foglio biadesivo (spessore $\approx \SI{60}{\um}$)
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$\bullet$~Etanolo assoluto ($> 99.8\%$)
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$\bullet$~Silicone
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$\bullet$~Carta assorbente
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\end{tabular}
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\begin{algorithmic}[1]
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\STATE Preparare una cella di flusso con microsfere in nitrocellulosa
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immobilizzate come descritto nel protocollo \ref{proto:silica_beads_flow_cell}
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\STATE Immettere, da un lato della cella di flusso, un volume di soluzione di BSA biotilinata e,
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una volta riempita la cella, incubare 2/3 minuti.
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\STATE Immettere nella cella di flusso un volume di soluzione di fluoroforo streptavidinato, una volta riempita la cella incubare per 4 minuti.
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\STATE Lavare la cella con 4-5 volumi di Buffer AB
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\STATE Immettere nella cella un volume di Imaging Buffer.
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\STATE Sigillare i lati aperti della cella utilizzando del silicone.
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\end{algorithmic}
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\end{algorithm}
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