From de2e3750c1e94c3388f9ddf943c6c6a745f9a35f Mon Sep 17 00:00:00 2001 From: Lorenzo Zolfanelli Date: Mon, 12 Oct 2020 22:50:22 +0200 Subject: [PATCH] ortograf + bib + proto --- chapters/1-introduction.tex | 2 +- chapters/2-setup.tex | 10 +++---- chapters/3-methods.tex | 4 +-- chapters/A2-electronics.tex | 52 +++++++++++++++++++------------------ chapters/A3-protocols.tex | 47 ++++++++++++--------------------- references.bib | 14 ++++++++++ 6 files changed, 66 insertions(+), 63 deletions(-) diff --git a/chapters/1-introduction.tex b/chapters/1-introduction.tex index e9dd0ed..c13d54d 100644 --- a/chapters/1-introduction.tex +++ b/chapters/1-introduction.tex @@ -846,7 +846,7 @@ di applicazione della microscopia TIRF. Quando è necessario individuare fluorofori che si trovano a una profondità maggiore di poche centinaia di nanometri rispetto al vetrino coprioggetti questa tecnica non è più utilizzabile. Inoltre, come recentemente -evidenziato \cite{}, esistono limiti che mettono in discussione +evidenziato \cite{Oheim2019}, esistono limiti che mettono in discussione l'applicabilità dell'equazione \ref{eq:depth} in situazioni reali; questa infatti non tiene conto di alcuni fattori, come la - seppur piccola - divergenza del fascio laser gaussiano, che non diff --git a/chapters/2-setup.tex b/chapters/2-setup.tex index 796c9d4..e26302c 100644 --- a/chapters/2-setup.tex +++ b/chapters/2-setup.tex @@ -589,13 +589,13 @@ eccitazione in uscita dall'obiettivo. & \\ DIC-Fluor & Filtro dicroico quad-edge - & Separazione eccitazione/emissione + & Separaz. ecc./emiss. & $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$ & Di03-R405/488/532/635-t1 \\ \multicolumn{5}{l}{\it Percorso trappole}\\ L-TS4a & Lente sferica piano-convessa - & Inserimento laser 1064nm in isolatore. + & Inser. 1064nm in isolatore. & %f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS4b @@ -638,7 +638,7 @@ eccitazione in uscita dall'obiettivo. & \\ DIC-BF & Filtro dicroico single-edge - & Seprazione fluorescenza/brightfied + & Sep. fluor/bf & $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$ & FF705-Di01-25x36\\ F-BlockBF @@ -648,12 +648,12 @@ eccitazione in uscita dall'obiettivo. & FESH0700\\ F-Emiss & Filtro passa-banda quad-band - & Fluorofori/Soppressione laser eccitazione + & Fluor/Soppr. laser ecc. & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$ & FF01-446/510/581/703\\ F-BlockTwz & Filtro band-stop - & Soppressione laser trappole residuo + & Soppressione laser 1064 & $\lambda_{centr}: 1064nm$ & \\ \end{tabular} diff --git a/chapters/3-methods.tex b/chapters/3-methods.tex index 615a4d7..fe37003 100644 --- a/chapters/3-methods.tex +++ b/chapters/3-methods.tex @@ -333,12 +333,12 @@ essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto. Per la calibrazione si procede a preparare un campione con una cella di flusso contenente microsfere di polistirene (di diametro \SI{0.9}{\um}). -Grazie a un'apposito programma sviluppato in ambiente LabVIEW +Grazie a un apposito programma sviluppato in ambiente LabVIEW (\texttt{Force-Clamp Calibration}) è possibile acquisire in maniera automatizzata le tracce del segnale prodotto dai QPD per una griglia di posizioni delle trappole. Il codice si occupa di memorizzare le tracce temporali, e per ogni posizione, spostare la trappola modificando -la frequenza inviata agli AOM. +la frequenza inviata agli AOD. Le tracce temporali vengono acquisite per una durata di \SI{10}{\second} per ogni posizione e a una frequenza di campionamento di \SI{200}{kS/s}. diff --git a/chapters/A2-electronics.tex b/chapters/A2-electronics.tex index f0529e0..9f564a2 100644 --- a/chapters/A2-electronics.tex +++ b/chapters/A2-electronics.tex @@ -2,7 +2,7 @@ \label{app:electronics} Il sistema elettronico che consente di applicare il ciclo di retroazione -tra la posizione rilevate della microsfera nelle trappole e la posizione di +tra le posizioni rilevate delle microsfere nelle trappole e le posizioni di queste ultime nel campione è reso particolarmente complesso dalla necessità di operare le correzioni in un tempo estremamente breve, per raggiungere un tempo di reazione significativamente inferiore al tempo di rilassamento diffusivo @@ -20,7 +20,7 @@ Questi possono essere configurati, in fase di programmazione della scheda, per eseguire determinate funzioni logiche. Una volta programmata, la scheda è in grado di eseguire le funzioni logiche impostate e elaborare segnali proveniente dall'esterno attraverso dei \textit{pin} di input. -Il risultato dell'elaborazione può essere immagazzinati in appositi registri +Il risultato dell'elaborazione può essere immagazzinato in appositi registri (code) e letto su richiesta (ad esempio di un computer esterno), oppure utilizzato per comandare dei \textit{pin} di output presenti sulla scheda. @@ -29,11 +29,11 @@ le componenti del circuito logico richiesto e quindi configurare i blocchi della scheda per \textit{realizzare} le funzioni del circuito integrato disegnato. -Uno dei principali vantaggi dell'uso di schede FPGA sta nel fatto che il tempo -di esecuzione delle singole operazioni è deterministico e riproducibile tra una -iterazione e all'altra, a differenza di quanto accade nei PC dove l'accesso -di ogni applicazione ai cicli di processore viene controllato da priorità -e schedulatori del sistema operativo. +Uno dei principali vantaggi dell'uso di schede FPGA sta nel fatto che +il tempo di esecuzione delle singole operazioni è deterministico e +riproducibile tra iterazioni successive, a differenza di quanto accade +nei PC dove l'accesso di ogni applicazione ai cicli di processore +viene controllato da priorità e schedulatori del sistema operativo. Per gli scopi di questa tesi è stata programmata una scheda FPGA per leggere i valori dei fotodiodi a quadrante (da cui si può estrapolare la posizione @@ -41,18 +41,19 @@ relativa delle microsfere rispetto al centro della trappola) e controllare l'angolo di deflessione dei laser delle trappole (e quindi la loro posizione nel campione). -Per ottenere questo risultato è stata scelta una scheda prodotta FPGA prodotta -da National Instrument (USB-7855), programmabile attraverso interfaccia USB, -dotata di 48 canali digitali configurabili come output o input e 8 convertitori -analogico-digitali (ADC) integrati. +Per ottenere questo risultato è stata scelta una scheda FPGA prodotta +da National Instrument (USB-7855), programmabile attraverso +interfaccia USB, dotata di 48 canali digitali configurabili come +output o input e 8 convertitori analogico-digitali (ADC) integrati. -La logica di funzionamento è stata definita utilizzando l'ambiente di sviluppo -LabVIEW FPGA: questo permette di disegnare sotto forma di diagramma a blocchi -la sequenza di funzioni da applicare sui dati ingresso. -A partire da questo diagramma LabVIEW FPGA è in grado di generare il circuito -logico necessario e descriverlo (secondo le specifiche del linguaggio VHDL). -Un ulteriore passaggio converte il codice VHDL in istruzioni di programmazione -della scheda, che vengono eseguite attraverso la connessione USB. +La logica di funzionamento è stata definita utilizzando l'ambiente di +sviluppo LabVIEW FPGA: questo permette di disegnare sotto forma di +diagramma a blocchi la sequenza di funzioni da applicare sui dati in +ingresso. A partire da questo diagramma LabVIEW FPGA è in grado di +generare il circuito logico necessario e descriverlo (secondo le +specifiche del linguaggio VHDL). Un ulteriore passaggio converte il +codice VHDL in istruzioni di programmazione della scheda, che vengono +eseguite attraverso la connessione USB. \begin{figure}[ht] \centering @@ -69,7 +70,7 @@ collegata direttamente ai convertitori analogico/digitali dell'FPGA. La differenza tra il segnale misurato in ingresso e il set-point viene trasformata, attraverso un fattore di conversione determinato in fase di calibrazione, in una variazione della frequenza del segnale elettronico -inviato ai trasduttori presenti sui modulatori acusto ottici. +inviato ai trasduttori presenti sui deflettori acusto ottici. La generazione del segnale elettronico alla frequenza richiesta è delegata a due generatori digitali di segnale (DDS, Direct Digital @@ -102,18 +103,19 @@ e ha richiesto un'analisi precisa del segnale trasportato su ciascun conduttore del bus tra FPGA e DDS. In ultima analisi si è rilevato come fenomeni di \textit{diafonia} tra i vari conduttori presenti sul cavo utilizzato per connettore l'FPGA ai DDS -(cavo fornito da National Instrument) portino ad un allungamento del +(cavo fornito da National Instrument) portino ad un allungamento del transiente necessario affinché tutti i bit del bus raggiungano il valore impostato. Si è quindi dovuto procedere a rallentare la velocità di scrittura delle singole \textit{word} sui DDS, inserendo un piccolo tempo morto -(nell'ordine dei nanosecondi) tra la scrittura della word e il trasferimento -nel registro di memoria. +(nell'ordine dei nanosecondi) tra la scrittura della \textit{word} e +il trasferimento nel registro di memoria. -In conclusione si è osservata una completa risoluzione dei problemi osservati -con una variazione dei tempi di reazione del sistema ampiamente trascurabile -rispetto al limiti dettati dal rate di campionamento del segnale dei QPD. +In conclusione si è osservata una completa risoluzione dei problemi +osservati con una variazione dei tempi di reazione del sistema +ampiamente trascurabile rispetto al limiti dettati dal rate di +campionamento del segnale dei QPD. diff --git a/chapters/A3-protocols.tex b/chapters/A3-protocols.tex index 7109452..d3f2ba9 100644 --- a/chapters/A3-protocols.tex +++ b/chapters/A3-protocols.tex @@ -60,7 +60,7 @@ immobilizzate} contenente microsfere e nitrocellulosa, in modo da eliminare eventuali aggregati. \STATE Vortexare per \SIrange{20}{30}{\second}, in modo da sospendere - omogenemaente le microsfere nel volume della soluzione. + omogeneamente le microsfere nel volume della soluzione. \STATE Prelevare con una micropipetta \SIrange{1}{2}{\uL} di soluzione. \STATE Depositare la soluzione sopra un vetrino coprioggetti, tenendolo fermo con la punta della pipetta e utilizzando un secondo vetrino per @@ -81,17 +81,22 @@ immobilizzate} \centering \includegraphics{images/flow_cell.pdf} \caption{Realizzazione di una cella di flusso} - \label{fig:my_label} + \label{fig:flow_cell} \end{figure} \begin{algorithm}[ht] \caption{Cella di flusso con fluoroforo immobilizzato} -\label{proto:silica_beads_flow_cell} +\label{proto:alexa} \begin{tabular}{p{2cm} p{12cm}} \textbf{Materiale \mbox{necessario}:} & - $\bullet$~Soluzione con fluoroforo streptavidinato + $\bullet$~Soluzione con fluoroforo streptavidinato (Alexa Fluor) + $\bullet$~Soluzione con microsfere in nitrocellulosa + (vedi Protocollo \ref{proto:silica_beads}) + $\bullet$-Soluzione di albumina sierica bovina (BSA) biotilinata + $\bullet$-Buffer AB (100mM Tris-\ce{HCl}, 20mM \ce{MgCl2}, 500mM \ce{KCl}, 50mM carbonato guanidina, pH 7.5) + $\bullet$-Imaging Buffer (buffer AB addizionato con 1.2 \si{\micro M} glucosio ossidasi [Sigma G7141], 0.2 \si{\micro M} catalasi [Sigma C40], 17 mM glucosio, 20 mM DTT) $\bullet$~Acqua ultrapura Milli-Q\textsuperscript{®} $\bullet$~Vetrino portaoggetti $\bullet$~Vetrini coprioggetti \#0 (spessore \SI{100}{\um}) @@ -101,31 +106,13 @@ immobilizzate} $\bullet$~Carta assorbente \end{tabular} \begin{algorithmic}[1] - \STATE Pulire accuratamente un vetrino portaoggetti e due vetrini - coprioggetti, risciacquandoli con etanolo su entrambi i lati. - \STATE Far evaporare completamente il solvente. - \STATE Ritagliare delle strisce sottili e lunghe (circa - \SIlist{2x50}{\mm}) di foglio biadesivo. - \STATE Preparare le celle di flusso sul vetrino coprioggetti utilizzando - le striscette adesive (come in figura), lasciando la pellicola - protettiva superiore. - \STATE Sonicare per \SIrange{1}{2}{\minute} minuti la soluzione - contenente microsfere - e nitrocellulosa, in modo da eliminare eventuali aggregati. - \STATE Vortexare per \SIrange{20}{30}{\second}, in modo da sospendere - omogenemaente le microsfere nel volume della soluzione. - \STATE Prelevare con una micropipetta \SIrange{1}{2}{\uL} di soluzione. - \STATE Depositare la soluzione sopra un vetrino coprioggetti, tenendolo - fermo con la punta della pipetta e utilizzando un secondo vetrino per - stendere uniformemente la soluzione, poi lasciare riposare \SI{5}{\minute}. - \STATE Rimuovere le pellicole protettive dagli adesivi sul vetrino - coprioggetti, creare le celle di flusso chiudendo il vetrino - coprioggetti sul vetrino portaoggetti, assicurandosi che la superficie - rivestita con la soluzione rimanga interna alla cella. - \STATE Immettere acqua ultrapura, utilizzando una micropipetta, da un lato - della cella di flusso, fino a riempirla completamente. Utilizzare se - necessario un pezzo di carta assorbente per agevolare il flusso - dell'acqua attraverso la cella. + \STATE Preparare una cella di flusso con microsfere in nitrocellulosa + immobilizzate come descritto nel protocollo \ref{proto:silica_beads_flow_cell} + \STATE Immettere, da un lato della cella di flusso, un volume di soluzione di BSA biotilinata e, + una volta riempita la cella, incubare 2/3 minuti. + \STATE Immettere nella cella di flusso un volume di soluzione di fluoroforo streptavidinato, una volta riempita la cella incubare per 4 minuti. + \STATE Lavare la cella con 4-5 volumi di Buffer AB + \STATE Immettere nella cella un volume di Imaging Buffer. \STATE Sigillare i lati aperti della cella utilizzando del silicone. \end{algorithmic} -\end{algorithm} \ No newline at end of file +\end{algorithm} diff --git a/references.bib b/references.bib index 05bba7e..4e1f5af 100644 --- a/references.bib +++ b/references.bib @@ -203,4 +203,18 @@ author = {P. Welch}, title = {The use of fast Fourier transform for the estimation of power spectra: A method based on time averaging over short, modified periodograms}, journal = {{IEEE} Transactions on Audio and Electroacoustics} +} + +@article{Oheim2019, + doi = {10.1016/j.bpj.2019.07.048}, + _url = {https://doi.org/10.1016/j.bpj.2019.07.048}, + year = {2019}, + month = sep, + publisher = {Elsevier {BV}}, + volume = {117}, + number = {5}, + pages = {795--809}, + author = {Martin Oheim and Adi Salomon and Adam Weissman and Maia Brunstein and Ute Becherer}, + title = {Calibrating Evanescent-Wave Penetration Depths for Biological {TIRF} Microscopy}, + journal = {Biophysical Journal} } \ No newline at end of file