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      chapters/2-setup.tex
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      chapters/3-methods.tex
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  6. BIN
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  9. +521
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      images_src/bfp.svg

+ 3
- 3
chapters/1-introduction.tex View File

@ -136,7 +136,7 @@ rispetto alla zona illuminata nelle vicinanze del vetrino coprioggetti.
Scopo dell'apparato sperimentale sarà anche studiare la possibilità di
superare questo limite usando la sfera dielettrica come risuonatore
o foceggiatore ottico, e quindi come strumento in grado di trasferire la radiazione
o focheggiatore ottico, e quindi come strumento in grado di trasferire la radiazione
di eccitazione dall'immediata prossimità del vetrino coprioggetti ai
fluorofori presenti in prossimità del sito di interazione.
In questo modo il segnale proveniente da molecole fuori fuoco,
@ -228,7 +228,7 @@ di actina del citoscheletro.
Oltre a questa connessione diretta esistono altre proteine che
mantengono una connessione indiretta, legando ad esempio le catenine
con il citoscheletro. É stato scoperto
con il citoscheletro. È stato scoperto
\cite{Goldmann2016,Dumbauld2014} che le proteine
\emph{vinculina} e \emph{$\alpha$-actinina} svolgono questa attività.
@ -481,7 +481,7 @@ scattering e una energia cinetica delle particelle intrappolate
sufficientemente bassa (quindi un fluido sufficientemente viscoso).
Per le nostre applicazioni è sufficiente considerare, su un piano
perpendicolare alla dirazione di propagazione del fascio, una forza di
perpendicolare alla direzione di propagazione del fascio, una forza di
richiamo del tipo:
\begin{equation}


+ 2
- 2
chapters/2-setup.tex View File

@ -65,7 +65,7 @@ a stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per la
microscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgenti
laser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} e
l'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccolta
e disaccopiata dall'illuminazione a luce trasmessa.
e disaccoppiata dall'illuminazione a luce trasmessa.
Tuttavia, la necessità di ottenere una sensibilità di singola molecola
rende particolarmente critica la scelta delle caratteristiche
@ -168,7 +168,7 @@ i protocolli di comunicazione GCS per i moduli Physik Instrumente
e GC \cite{gclib} per il modulo Galil Motion Control.
Per semplificare l'utilizzo dei tre gli attuatori durante
la manipolazione di un campione è stato propgramma
la manipolazione di un campione è stato programma
in ambiente LabVIEW che implementa i protocolli di comunicazione
richiesti (\texttt{Joystick Control}).
In particolare il codice sviluppato consente di utilizzare


+ 69
- 28
chapters/3-methods.tex View File

@ -12,11 +12,14 @@ del nanometro, precludendo la possibilità di poter eseguire misurazioni
di forza con la sensibilità del \si{pN}.
Gli effetti più evidenti e rilevabili sono rapide oscillazioni della
posizione del campione dovute a vibrazioni acustiche residue e, quando
queste non vengono corrette, una
progressiva deriva rispetto alla posizione fissata che diventa
significativa ($> \SI{100}{\nm}$) per tempi di osservazione di
diversi minuti.
posizione del campione dovute a vibrazioni acustiche residue e,
in aggiunta a queste, una più lenta deriva della posizione dovuta
alla dilatazione o alla compressione delle strutture del microscopio
in conseguenza delle fluttuazioni termiche.
Senza alcuna correzione, sono sufficienti fluttuazioni termiche
dell'ordine dei decimi di grado per causare, su tempi di osservazione
di qualche minuto, una significativa e progressiva deriva rispetto
alla posizione iniziale ($> \SI{100}{\nm}$).
Per quantificare quest'effetto viene usato un apposito campione in cui
diverse microsfere in silice, di diametro \SI{0.5}{\um}, vengono
@ -29,8 +32,10 @@ in dettaglio nell'appendice \ref{app:protocols}, protocollo
Le microsfere immobilizzate nel campione possono essere messe a fuoco
e visualizzate attraverso il sistema di microscopia a luce trasmessa.
Una volta selezionata e messa a fuoco una microsfera, analizzando
l'immagine prodotta da uno dei due sensori CMOS è possibile calcolare
le coordinate (in pixel) del suo centroide:
l'immagine prodotta da uno dei due sensori CMOS è possibile, dopo aver
filtrato i pixel con una soglia d'intensità ($I_S$) determinate empiricamente,
in modo da non considerare il segnale residuo nello sfondo, calcolare
le coordinatedel suo centroide:
\begin{equation}
(x_{cen}, y_{cen}) =
@ -40,7 +45,11 @@ le coordinate (in pixel) del suo centroide:
\sum_{(x, y)} I(x, y)
}
\end{equation}
La sommatoria si intende estesa a tutti i pixel con coordinate $(x, y)$
dell'immagine che verificano la condizione di soglia $I(x, y) > I_s$.
$I(x, y)$ è l'intensità del pixel misurata in unità del CMOS.
Per evitare di considerare altre microsfere o imperfezioni sul campione
si sceglie di effettuare il calcolo del centroide limitando la regione
dell'immagine utilizzata a un rettangolo nel quale una microsfera è
@ -48,9 +57,9 @@ sufficientemente isolata.
Ricalcolando il centroide a intervalli temporali fissati è possibile
osservare la deriva della posizione (x, y) della microsfera.
Inoltre si ha la possibilità sfruttare questo stesso campione per effettuare
una calibrazione del fattore di conversione pixel/nm lungo due assi
ortogonali.
Inoltre si ha la possibilità di sfruttare questo stesso campione per effettuare
una calibrazione del fattore di conversione pixel/nm della telecamera
lungo due assi ortogonali.
Per effettuare la calibrazione, dopo aver calcolato il centroide
della microsfera, si sposta la posizione dal campione lungo uno dei
@ -72,18 +81,22 @@ radiale della luce diffusa dalla microsfera.
In figura \ref{fig:radial_itensity} è rappresentato l'andamento del
profilo radiale che si ottiene variando la quota del piano focale (z).
Il profilo radiale è stato calcolato, dopo aver determinato il centroide
della microsfera, per ogni valore intero di $r$, come la media delle
intensità dei pixel la cui distanza dal centro (approssimata all'intero
più vicino) sia uguale a $r$.
\begin{figure}[ht]
\centering
\includegraphics{images/radial_intensity.pdf}
\caption{Profilo di intensità radiale rispetto al centroide
per una microsfera, in diversi piani }
per una microsfera, in diversi piani.}
\label{fig:radial_itensity}
\end{figure}
Da questi dati è stato possibile osservare che il rapporto tra
l'intensità integrata in un anello centrato sulla microsfera e quella
integrata nella regione interna al medesimo anello (regioni gialle
e arancioni in figura), mostra un andamento proporzionale alla quota
integrata nella regione interna al medesimo anello (regioni arancioni
e gialle in figura), mostra un andamento proporzionale alla quota
del piano focale in un certo intorno del centro della sfera.
In figura \ref{fig:z_est} viene mostrato l'andamento del rapporto
@ -107,6 +120,25 @@ una calibrazione spostando il campione di una quota controllata
attraverso il traslatore piezoelettrico dell'obiettivo, e costruire
una curva di calibrazione come quella in figura \ref{fig:z_est}.
La curva in figura \ref{fig:z_est} è stata realizzata acquisendo dieci
immagini per ciascuna quota e campionando la quota a passi di 300
nm. Per la regione in cui l’andamento è lineare (delimitata tra le
barre rosse in figura, tra \SI{2.8}{\um} e \SI{5.6}{\um}) è stato
eseguito un fit lineare ottenendo i seguenti parametri:
\begin{table}[ht]
\centering
\begin{tabular}{ l l l }
\toprule
{\it Nome parametro} & {\it Valore} & {\it Err. percentuale}\\
\midrule
Costante & $(0.9520\pm0.0025)$ & 0.26\% \\
Pendenza & $(0.0206\pm0.0006)\si{\um^{-1}}$ & 2.9\% \\
\bottomrule
\end{tabular}
\caption{Parametri del fit per la determinazione di z a partire dalle immagini.}
\end{table}
Conoscendo quindi tre fattori di calibrazione è possibile, partendo
da un'immagine della microsfera, ottenere una stima della sua
posizione nello spazio tridimensionale. Questo ci permette
@ -117,7 +149,7 @@ eseguono le misurazioni di forza è possibile rilevare gli spostamenti
del campione e compensarli inviando appositi comandi ai traslatori
piezoelettrici.
In ambiente LabVIEW è stato sviluppato un codice di controllo
In ambiente LabVIEW ho sviluppato un codice di controllo
che implementa un meccanismo di retroazione tra le letture sulla
posizione della sfera e i traslatori piezoelettrici.
Il codice consente all'operatore di selezionare la regione
@ -132,10 +164,6 @@ arrivare fino a \SI{100}{\Hz}), viene comandato ai traslatori
uno spostamento proporzionale alla differenza tra la posizione della
sfera rilevata e quella iniziale.
Quando il sistema di stabilizzazione meccanica viene attivato
è stato possibile mostrare che la posizione media del campione resta
stabile indipendentemente dal tempo di osservazione, con fluttuazioni
che hanno una deviazione standard di circa \SI{1}{\nm}.
Il fattore di proporzionalità del ciclo di retroazione
(guadagno, $g$) influenza
le caratteristiche della risposta del sistema: un fattore troppo
@ -144,7 +172,8 @@ oscillazioni smorzate, mentre un fattore troppo piccolo aumenterà
inutilmente il tempo di risposta. Per trovare il valore ottimale
si osserva la risposta del sistema per diversi valori di $g$, in
seguito ad una perturbazione fittizia ottenuta modificando di
\SI{50}{\nm} il \textit{set point} lungo una direzione.
\SI{50}{\nm} il \textit{set point} del sistema di retroazione
lungo una direzione.
In figura \ref{fig:step_response} si riporta la risposta del
sistema di stabilizzazione per gli assi $x$ e $z$ a diversi valori
del fattore di proporzionalità $g$.
@ -157,6 +186,10 @@ del fattore di proporzionalità $g$.
\label{fig:step_response}
\end{figure}
Quando il sistema di stabilizzazione meccanica viene attivato
è stato possibile mostrare che la posizione media del campione resta
stabile indipendentemente dal tempo di osservazione, con fluttuazioni
che hanno una deviazione standard di circa \SI{1}{\nm}.
L'acquisizione di diverse tracce della durata di 5-10 minuti ha
sempre mostrato deviazioni standard delle fluttuazioni comprese
tra \SIlist{1;2}{\nm}.
@ -179,7 +212,7 @@ fluttuazioni della posizione del campione, con (nero) e senza
Per poter eseguire misurazioni di forza su sistemi biologici è
fondamentale riuscire a conoscere il valore della tensione applicata
alle microsfere intrappolate nelle pinzette ottiche. Questo si può
effettuare poriché l'azione di una pinzetta ottica su una
effettuare poiché l'azione di una pinzetta ottica su una
microsfera può essere modellizzata come una forza di richiamo
elastica (vedi sezione \ref{sec:ot}).
@ -262,30 +295,30 @@ per i valori di $k$ ottenibili con il nostro sistema di pinzette
ottiche è possibile ridurre $\tau_{\textrm{diff}}$ fino a circa
\SI{100}{\us}.
Il tempo di risposta del sistema nel regime balistico è quindi
Il tempo di risposta del sistema nel regime balistico è quindi
completamente trascurabile, e il transiente tra una perturbazione
e la stabilizzazione nella nuova posizione di equilibrio può
essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto.
Il protocollo di calibrazione sviluppato consente, partendo
dal campionamento della posizione relativa della
microsfera lungo un'asse spaziale, di determinare con precisione i
valori di $\tau$, e quindi di $k$ per ogni posizione della
trappola.
Per fare questo si tiene conto che la densità spettrale
delle fluttuazioni della posizione è data da \cite{Gittes1998}:
\begin{equation}
S_x(\nu) = \frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)}
\end{equation}
Dove $\nu_c = 1 / (2\pi\tau) = k / 2\pi\gamma$ é
la frequenza di taglio, inversamente proporzionale al tempo
di rilassamento.
Da un semplice $fit$ della distribuzione spettrale del rumore
della posizione è possibile quindi estrarre il valore di k.
Il segnale misurabile in uscita dagli amplificatori differenziali dei QPD è un segnale in tensione,
compreso tra \SIlist{-10;+10}{\V}, proporzionale alla
posizione relativa della microsfera.
@ -314,6 +347,15 @@ trappola la distribuzione spettrale di rumore, utilizzando un algoritmo
per la trasformata di Fourier veloce (\textit{Fast Fourier Transform}, FFT),
con i parametri riportati in tabella \ref{tab:fft_par}.
Il limite teorico imposto dal teorema di Shannon fissa a \SI{100}{\kHz} la
massima frequenza rilevabile, tuttavia si sceglie di tagliare la coda
finale dello spettro selezionando solo le frequenze compresa tra \SI{15}{\Hz}
e \SI{50}{\kHz}. Mentre in questo intervallo la sensibilità del rilevatore al
silicio usato nei QPD è relativamente costante, inizia a decrescere
per frequenze maggiori, e la coda finale dello spettro delle
fluttuazioni viene nascosta dal rumore elettronico e altri disturbi,
come quelli generati ad esempio dagli alimentatori AC/DC.
\begin{table}[ht]
\centering
\begin{tabular}{>{\bf}l l}
@ -323,7 +365,6 @@ con i parametri riportati in tabella \ref{tab:fft_par}.
Lunghezza segmenti & N/32 \\
Finestra & Hann \\
\bottomrule
\end{tabular}
\caption{Parametri FFT}
\label{tab:fft_par}


BIN
images/aom.pdf View File


BIN
images/bfp.pdf View File


BIN
images/radial_intensity.pdf View File


BIN
images/z-est.pdf View File


+ 7
- 7
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@ -1,7 +1,7 @@
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