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\chapter{Apparato sperimentale}
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\label{cap:setup}
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L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopio
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invertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanica
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del LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistema
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di due pinzette ottiche posizionabili attraverso deflettori acusto-ottici
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e con uno
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schema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungere
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la sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemi
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di illuminazione (campo largo, TIRF, HILO).
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Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura
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\ref{fig:microscope}.
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Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e il
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funzionamento simultaneo - minimizzando le sovrapposizioni
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spettrali - dei tre principali
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schemi di microscopia e manipolazione:
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\begin{description}
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\item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una
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sorgente LED viene collimata da un
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condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso
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il campione.
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L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce
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trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita dello stesso.
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\item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono
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collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo,
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quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono
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essere usati per intrappolare e manipolare microsfere
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in soluzione. La radiazione laser che attraversa
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il campione e viene raccolta dal condensatore può essere
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analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo
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spostamento dal centro delle sfere intrappolate.
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\item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene
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focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e
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quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La
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radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione
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viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso
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un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio
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di eccitazione.
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\end{description}
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\begin{figure}[ht]
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\centering
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\includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf}
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\caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi
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ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.}
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\label{fig:microscope}
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\end{figure}
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Per evitare interferenze è stato necessario
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scegliere opportune lunghezze d'onda per i tre schemi ottici
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e, di conseguenza, appropriati specchi dicroici
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e filtri.
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L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando una
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sorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm},
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le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un laser
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a stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per la
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microscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgenti
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laser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} e
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l'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccolta
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e disaccoppiata dall'illuminazione a luce trasmessa.
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Tuttavia, la necessità di ottenere una sensibilità di singola molecola
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rende particolarmente critica la scelta delle caratteristiche
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spettrali e di qualità delle sorgenti e delle componenti ottiche
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utilizzate. In particolare, come vedremo nel dettaglio in sezione
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\ref{sec:stabilization}, la stabilizzazione meccanica del sistema
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richiede un’illuminazione a luce trasmessa del campione di intensità
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sufficiente a produrre una chiara immagine delle microsfere
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immobilizzate sui sensori CMOS. Allo stesso tempo, la microscopia di
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fluorescenza richiede la rilevazione di segnali estremamente deboli,
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attraverso un sensore di tipo EmCCD raffreddato estremamente
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sensibile. In questo contesto, anche il passaggio di pochi fotoni al
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secondo tra i due cammini ottici comprometterebbe la sensibilità del
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sistema. Per risolvere questo problema è state scelta una sorgente LED
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con un profilo di emissione sufficientemente lontano dalle lunghezze
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d’onda usate per la fluorescenza (400-700 nm) e il posizionamento di
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un filtro ad alta efficienza per per eliminare l’emissione residua del
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LED nella regione di sovrapposizione. Un altra serie di filtri ad
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altra efficienza è stata posta in prossimità del sensore EMCCD,
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procendendo anche alla completa separazione spaziale (attraverso tubi,
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diaframmi e separatori) del cammino ottico, in modo eliminare quasi
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completamente la componente di radiazione LED che raggiunge la
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camera. L’utilizzo di un LED con emissione centrata nel vicino
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infrarosso, con lunghezza d’onda sensibilmente più vicina al diametro
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delle microsfere utilizzate, ha inoltre effetti significativi sul
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profilo radiale di intensità delle immagini prodotte delle
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microsfere. Questa differenza, rispetto ai profili osservati con un
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illuminazione alle lunghezze d’onda del visibile, ha reso necessario
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lo sviluppo ex-novo di un algoritmo per la determinazione della
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posizione del piano focale rispetto al centro della sfera, descritto
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sempre in sezione \ref{sec:stabilization}.
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\section{Microscopio e traslatori}
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Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituiscono
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il microscopio sono assemblati su una struttura metallica
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personalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS.
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Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattro
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elastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuare
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significativamente le vibrazioni meccaniche.
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Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimento
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attraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa.
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Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarie
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per gli esperimenti viene caricata in una camera di reazione
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realizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti).
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Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraverso
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quattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore corto
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raggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il
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\textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}.
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Per gli scopi di questa tesi sono stati usati due obiettivi
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differenti:
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\begin{itemize}
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\item Un obiettivo planapocromatico 60x a immersione ad acqua, con
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alta apertura numerica ($NA = 1.22$) e distanza di lavoro di
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\SI{0.2}{\mm} (Nikon)
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\item Un obiettivo TIRF 60x a immersione a olio, con alta apertura
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numerica ($NA = 1.49$) e distanza di lavoro di \SI{0.13}{\mm}
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(Nikon).
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\end{itemize}
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Il primo obiettivo presenta le caratteristiche migliori per quanto
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riguarda l'efficienza delle pinzette ottiche, anche a profondità
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significative all'interno del campione.
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Il secondo obiettivo invece permette la realizzazione di schemi di
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illuminazione TIRF, al prezzo di un'efficienza delle pinzette ottiche
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che decresce rapidamente all'aumentare del volume di campione
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attraversato.
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La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico può
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essere modificata attraverso due traslatori controllati
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elettronicamente, uno, il traslatore a corto raggio, di tipo
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piezoelettrico (Physik Instrumente, P-527) per spostamenti veloci e
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con risoluzione di \SI{1}{\nm}, con una corsa di \SI{100}{\um} per
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asse, e l'altro, il translatore a lungo raggio, dotato di un motore
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piezoelettrico (Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con
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una corsa di \SI{50}{\mm} per asse e risoluzioni di \SI{100}{\nm}.
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Il piano focale può essere modificato variando la posizione
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dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico
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(Physik Instrumente, PIFOC™ P-725) con con una corsa di \SI{400}{\um}
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e risoluzione di \SI{2}{\nm}. Il microscopio è stato progettato in modo
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che al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenza
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della superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campione
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preparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti).
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I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivo
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sono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente
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E-517 e E-665) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in
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modalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungo
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raggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito da
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Galil Motion Control e equipaggiati di un \textit{encoder} che
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permette la selezione e il monitoraggio della velocità di spostamento.
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Le tre unità di controllo sono connesse ad un PC mediante interfaccia
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seriale RS232 e possono essere programmate e controllate usando
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i protocolli di comunicazione GCS per i moduli Physik Instrumente
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e GC \cite{gclib} per il modulo Galil Motion Control.
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Per semplificare l'utilizzo dei tre gli attuatori durante
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la manipolazione di un campione è stato programma
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in ambiente LabVIEW che implementa i protocolli di comunicazione
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richiesti (\texttt{Joystick Control}).
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In particolare il codice sviluppato consente di utilizzare
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levette analogiche e cursori di un \textit{controller} della console
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Xbox 360 (Microsoft) per inviare comandi agli attuatori, rendendo la
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manipolazione del campione particolarmente semplice e intuitiva.
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\section{Illuminazione a luce trasmessa}
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La radiazione emessa da un LED ad alta intensità (Thorlabs, M780L3)
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con picco di emissione centrato nell'infrarosso, a \SI{780}{nm}, viene
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filtrata con un filtro passa-basso (Thorlabs, FEHL0750) in modo da
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sopprimere l'emissione a lunghezze d'onda inferiori a \SI{750}{nm} che
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andrebbe a interferire con il rilevamento della fluorescenza.
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Successivamente, con l'ausilio di una singola lente e un accoppiatore
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in fibra (Thorlabs), la radiazione emessa dal LED e filtrata viene
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immessa in una fibra ottica e trasportata in corrispondenza del
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microscopio. All'altra estremità della fibra, in basso a destra nello
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schema ottico mostrato in figura \ref{fig:setup}, un sistema formato
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da un collimatore, un diaframma e una lente (\texttt{L-BF} nello
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schema) aggiusta le dimensioni e la divergenza del fascio di
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illuminazione, focalizzandolo sul piano focale posteriore del
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condensatore. Il fascio di illuminazione collimato illumina il
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campione, lo attraversa e la radiazione trasmessa e diffusa viene
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raccolta dall'obiettivo. Gli obiettivi usati sono corretti
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all'infinito, questo significa che le aberrazioni sono corrette quando
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il campione è posto sul piano focale anteriore dell'obiettivo e i
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raggi provenienti da tale piano e in uscita dall'obiettivo sono
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collimati. Inserendo nel percorso ottico una \textit{tube lens}
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(\texttt{L-Im1}), posta dopo il dicroico di fluorescenza
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(\texttt{DIC-Fluor}), l'immagine viene quindi formata sul piano focale
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(\texttt{Image plane}) della stessa lente. La distanza focale
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dell'obiettivo è di \SI{3.3}{\mm}, quella della \textit{tube lens} di
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\SI{250}{\mm}. Otteniamo quindi la formazione di un'immagine del
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piano del campione selezionato a una distanza di \SI{250}{\mm} dalla
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lente e con un fattore di ingrandimento $M = 250/3.3 \approx 75$.
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Questa immagine viene ulteriormente ingrandita mediante l'uso di
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un'ulteriore lente (\texttt{L-Im2}) con distanza focale \SI{75}{\mm}
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posta a \SI{350}{mm} dalla lente di tubo. In questo modo si ottiene,
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a una distanza di \SI{30}{\cm} dall'ultima lente, un ulteriore
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ingrandimento di un fattore $M' = 300 / (350-250) = 3$. A questa
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distanza l'immagine viene rilevata, dopo aver diviso il cammino ottico
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in due rami con un \textit{beam-splitter} (\texttt{BS-BF}), da due
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sensori CMOS monocromatici (Thorlabs DCC1545M). La potenza viene
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suddivisa tra i due sensori secondo il rapporto 90:10. Il sensore che
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riceve la frazione maggiore di potenza sarà utilizzato per il sistema
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attivo di stabilizzazione meccanica (descritto in sezione
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\ref{sec:stabilization}), dopo aver filtrato la radiazione residua a
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\SI{1064}{\nm} con un apposito filtro (\texttt{F-BlockTwz}); l'altro
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sensore verrà utilizzato per mostrare costantemente su un monitor
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l'immagine del campione.
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I sensori CMOS usati hanno una risoluzione di \SI{1280x1024}{pixel} e
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un'area attiva di \SI{6.66x5.32}{\mm}, corrispondenti a una dimensione
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di \SI{5.2x5.2}{\um} per ogni pixel. La velocità di acquisizione è di
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\SI{30}{fps} per l'intera superficie del sesnore, ma è possibile
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incrementarla riducendo la dimensione della regione
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d'interesse.
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Tenendo conto del fattore complessivo di ingrandimento
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($75\times 3 = 225$) un'immagine completa corrisponde a una regione
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del campione \SI{30x24}{\um}, la dimensione di un singolo pixel
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corrisponde invece ad un quadrato di lato \SI{23}{\nm} sul campione.
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I valori corretti possono essere determinati solo sperimentalmente
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dopo aver fissato l'allineamento del percorso ottico e delle
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telecamere.
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Per ottenere i fattori reali di conversione tra pixel e dimensioni sul
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campione ho sviluppato un programma in ampiente LabVIEW che,
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sfruttando una microsfera immobilizzata sul vetrino portaoggetti,
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consente di eseguire una calibrazione assistita (sezione
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\ref{sec:stabilization}).
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\section{Pinzette ottiche}
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\label{sec:tweezer}
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Il fascio \textit{laser} collimato in uscita da una sorgente
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\ce{Nd}:\ce{YVO4}, in alto a destra nello schema di figura
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\ref{fig:setup}, dopo essere stato ridotto in diametro
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grazie a un telescopio (lenti \texttt{L-TS4a} e \texttt{L-TS4b}),
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attraversa immediatamente una serie di due isolatori
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ottici, necessari per ridurre al minimo le instabilità della sorgente
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dovute alla retro-riflessione, e viene nuovamente ingrandito con un
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secondo telescopio (lenti \texttt{L-TS5a} e \texttt{L-TS5b}).
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Successivamente, dopo aver attraversato una lamina $\lambda/2$,
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viene diviso da un \textit{beam splitter} polarizzatore (\texttt{BS-Twz1})
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in due fasci ortogonali.
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I due fasci avranno polarizzazioni parallele o perpendicolari rispetto
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alla superficie del tavolo ottico, e la lamina $\lambda/2$ consente di
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modificare la ripartizione di potenza tra i due rami.
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I due rami vengono ricombinati utilizzando un secondo cubo
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polarizzatore (\texttt{BS-Twz2}), dopo aver attraversato due
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deflettori acusto-ottici
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(\textit{Acousto Optic Deflector, AOD}).
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Gli AOD vengono realizzati ponendo un cristallo di diossido
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di tellurio (\ce{TeO2}) in contatto
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con un trasduttore piezoelettrico: la radiofrequenza trasmessa al
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trasduttore consente l'instaurazione di un onda stazionaria acustica
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all'interno del cristallo, che si comporta sostanzialmente come un
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reticolo di diffrazione. Variando l'ampiezza e la frequenza del
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segnale
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elettrico inviato agli AOD è possibile modificare le caratteristiche
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dell'onda acustica stazionaria nel cristallo, e quindi ottenere una
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deflessiondel fascio in uscita.
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Gli elementi ottici sono allineati in modo che quando a entrambi
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gli AOD viene applicato un segnale di \SI{75}{MHz} i due rami
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incidano perpendicolarmente sull'ultimo cubo polarizzatore e proseguano
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il loro percorso esattamente sovrapposti (linea continua nella
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figura \ref{fig:aom}).
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\begin{figure}[ht]
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\centering
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\includegraphics[width=\linewidth]{images/aom.pdf}
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\caption{Schema per la realizzazione di due pinzette ottiche
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indipendenti.}
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\label{fig:aom}
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\end{figure}
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Una coppia di lenti piano-convesse incrementa la dimensione del fascio
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e rende il
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piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il piano
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delle uscite degli AOD. In questo modo, per qualsiasi deflessione
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angolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappole
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passeranno sempre collimati per il centro del piano focale posteriore
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dell'obiettivo, con angolo d'incidenza dipendente dalla radiofrequenza
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applicata. I fasci, quindi, attraversano l'obiettivo e vengono
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focalizzati dentro il campione propagandosi parallelamente all'asse
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ottico principale. La variazione di angolo di incidenza nel piano
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focale posteriore dell'obiettivo si tradue in uno spostamento
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orizzontale dei fasci nel piano del campione: in questo modo,
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regolando la radiofrequenza degli AOD è possibile spostare la posizione
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delle trappole lungo una linea orizzontale all'interno del campione.
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I fattori di conversione tra posizione della trappola nel campione e
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frequenza inviata all'AOD, determinati dalle caratteristiche degli AOD
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e dalla geometria del sistema ottico, vengono determinati a posteriori
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visualizzando microsfere intrappolate e creando rette di calibrazione
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(vedi sezione \ref{sec:calibration}).
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I deflettori acusto-ottici utilizzati (AA Opto-Electronic, DTSXY-250)
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sfruttano onde acustiche di taglio, in cui la velocità di propagazione
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dell'onda è perpendicolare al fascio in ingresso; in questo modo i
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nodi dell'onda stazionaria si dispongono lungo un asse parallela al
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banco ottico.
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Questo tipo di deflettori richiedono una polarizzazione in
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ingresso lineare e perpendicolare all'onda acustica e producono in uscita un fascio con polarizzazione ortogonale rispetto a quella in ingresso.
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Per questo nel
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percorso ottico vengono aggiunte due ulteriori lamine $\lambda / 2$:
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una permette di aver per entrambi gli AOD la stessa polarizzazione in
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ingresso, la seconda ruota nuovamente di \SI{90}{\degree} la
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polarizzazione di uno dei due fasci in modo che abbiano polarizzazione
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ortogonali prima di ricombinarsi. L'intervallo di scansione angolare
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consentito da questi AOD è di circa \SI{2.8}{\degree}, corrispondenti
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a variazioni di \SI{50}{\MHz} nella radiofrequenza fornita. Lungo
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questo intervallo l'efficienza dell'AOD, ovvero la frazione di fascio
|
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deflessa nel primo ordine di diffrazione, può variare
|
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significativamente. Questa dipendenza può essere nociva per gli
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esperimenti con le pinzette ottiche: se l'intensità dei fasci non è
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uniforme per tutte le posizioni della trappola, la costante elastica
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della pinzetta ottica varierà durante gli spostamenti, rendendo difficile la manipolazione
|
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del campione attraverso lunghe distanze e potenzialmente falsando i
|
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risultati degli esperimenti. Variando l'angolo di incidenza del
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fascio rispetto all'AOD è possibile ottimizzare questa dipendenza
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|
intorno a un intervallo di deflessioni angolari di nostro
|
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interesse. Resta comunque una variazione non trascurabile della
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rigidità delle trappole in funzione della posizione e per tenerne
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conto si utilizza un'apposita procedura di calibrazione in cui la
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rigidità viene misurata osservando la diffusione di una microsfera
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nella trappola, per una griglia equispaziata di punti
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(procedura descritta in sezione \ref{sec:calibration}).
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Per poter osservare e registrare gli spostamenti delle microsfere
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nella trappole così realizzate è stato implementato un sistema
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di rilevamento della radiazione nel piano focale posteriore del
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condensatore
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(\textit{back-focal plane detection}, BFPD).
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\begin{figure}[ht]
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\centering
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\includegraphics[width=\linewidth]{images/bfp.pdf}
|
|
\caption{Principio di funzionamento della \textit{back-focal-plane detection} e andamento della sensibilità al variare della
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|
dimensione dello \textit{spot}}
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\label{fig:bfp}
|
|
\end{figure}
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Il profilo d'intensità della luce diffusa in avanti da una microsfera
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in una trappola ottica, rilevato nel piano focale posteriore, permette
|
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di conoscere la posizione relativa della microsfera rispetto al centro
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della trappola, senza dipendere (in condizioni ideali) dalla posizione
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assoluta della trappola nel campione.
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|
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Per sfruttare questa proprietà la radiazione a \SI{1064}{\nm} è
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estratta dal cammino ottico successivo al condensatore grazie ad uno
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specchio dicroico. Successivamente le due polarizzazioni,
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corrispondenti alle due trappole, vengono separate da un cubo
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polarizzatore, e inviate rispettivamente a due fotodiodi a quadranti
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(\textit{Quadrant Photodiode Detector, QPD}), posizionati in un piano
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coniugato con il piano focale posteriore del condensatore.
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In questo piano la distribuzione spaziale del campo elettrico è data
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dalla trasformata di Fourier del campo in corrispondenza del piano
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del campione messo a fuoco. È possibile dimostrare che nel caso di
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una sfera spostata rispetto al centro della trappola l'asimmetria del
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profilo d'intensità nel piano focale posteriore sarà direttamente
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proporzionale allo spostamento della sfera rispetto al centro
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della trappola. Grazie ai due QPD possiamo quindi quantificare
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l'asimmetria del profilo d'intensità della radiazione diffusa
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in avanti lungo due assi ortogonali, ottenendo letture proporzionali
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agli spostamenti relativi della microsfera. Queste letture vengono
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prodotte da un sistema di amplificatori differenziali che opera
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sui quattro quadranti, producendo in uscita segnali la cui tensione,
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dopo opportuna calibrazione, può essere messa in relazione allo
|
|
spostamento della microsfera.
|
|
|
|
\begin{figure}[ht]
|
|
\centering
|
|
\includegraphics[width=\textwidth]{images/qpd.pdf}
|
|
\caption{Schema per la rilevazione della posizione relativa
|
|
della microsfera.}
|
|
\label{fig:qpd}
|
|
\end{figure}
|
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|
Maggiori dettagli sull'elettronica che consente il controllo
|
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della deflessione attraverso gli AOD e la lettura del segnale
|
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dei QPD sono forniti nell'appendice \ref{app:electronics}, mentre
|
|
le procedure di calibrazione sono trattate nella sezione
|
|
\ref{sec:calibration}.
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\section{Fluorescenza}
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Il percorso di eccitazione per la microscopia di fluorescenza
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è realizzato a partire da tre sorgenti \textit{laser}:
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\begin{itemize}
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\item \textbf{\SI[detect-weight = true]{488}{\nm}:}
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Cobolt MLD™ 488, con potenza regolabile tra
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\SIlist{0;60}{\mW} attraverso programma di controllo.
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\item \textbf{\SI[detect-weight = true]{532}{\nm}:}
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Coherent Sapphire, con potenza regolabile tra
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\SIlist{0;200}{\mW} attraverso manopola di controllo.
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\item \textbf{\SI[detect-weight = true]{635}{\nm}:}
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Blue Sky Research FTEC-2-635, con potenza regolabile tra
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\SIlist{0;60}{mW} attraverso modulazione analogica in
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tensione.
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\end{itemize}
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Le tre sorgenti si trovano fuori dal tavolo ottico e la radiazione
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viene trasportata attraverso tre fibre ottiche.
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Sul tavolo ottico la radiazione viene emessa nello spazio libero
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tramite tre collimatori con specifiche diverse.
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\begin{table}[ht]
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\centering
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\begin{tabular}{c c c c}
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\toprule
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$\lambda [\si{\nm}]$ & f [\si{\mm}] & $(\textrm{BD})_{1/e^2} ~[\si{\mm}]$ & M\\
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\midrule
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488 & 4 & 0.49 & 3.33x\\
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532 & 11 & 1.57 &\\
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635 & 6 & 1.07 & 1.66x\\
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\bottomrule
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\end{tabular}
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\caption{Collimatori usati per estrarre i fasci alle varie
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lunghezzed d'onda, con distanza focale indicata dal costruttore
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(f) e diametro del fascio (BD) misurato mediante \textit{fit}
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gaussiano del suo profilo d'intensità. Nella colonna
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M è riportato il fattore d'ingrandimento che abbiamo selezionato
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per ottenere fasci con dimensioni consistenti, attraverso l'utilizzo
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di telescopi.}
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\label{tab:my_label}
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\end{table}
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I fasci a \SIlist{488;635}{\nm} vengono ingranditi mediante due
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telescopi realizzati con lenti piano-convesse, in questo modo si
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ottengono dimensioni del fascio, e quindi caratteristiche di
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uniformità nell'illuminazione del campione, confrontabili e simili per
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tutte le lunghezze d'onda usate. Per il fascio a 635 nm si ottiene un
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fattore d’ingrandimento di 1.66x utilizzando le lenti \texttt{L-TS1a}
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e \texttt{L-TS1b}, per quello a \SI{488}{\nm} un fattore
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d’ingrandimento 3.33x utilizzando le lenti \texttt{L-TS2a} e
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\texttt{L-TS2b}. L'emissione dei laser a diodo deve essere filtrata
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attraverso filtri passa-banda stretti per evitare che radiazione a
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lunghezze d'onda spurie diffonda nel campione e contamini l'emissione
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di fluorescenza.
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I tre fasci laser vengono combinati in un unico percorso ottico
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attraverso due specchi dicroici (uno ottimizzato per riflettere il
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90\% della radiazione a lunghezze d'onda inferiori ai 532 nm,
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\texttt{DIC-532}, e l'altro per riflettere il 90\% di quelle inferiori
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a 488 nm, \texttt{DIC-488}). Successivamente il fascio con le tre
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lunghezze d'onda combinate viene ingrandito di un fattore 10x per
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mezzo di un ulteriore telescopio sul percorso comune, formato dalle
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lenti \texttt{L-TS3a} e \texttt{L-TS3b}, raggiungendo un diametro
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$\approx \SI{2}{\cm}$.
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I fasci combinati sono focalizzati sul piano focale posteriore
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dell'obiettivo da una lente con focale $f = \SI{500}{\mm}$, ottenendo,
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in combinazione con uno dei due obiettivi di focale \SI{3.3}{\mm},
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un fattore di scala di circa $1/150$ e quindi un diametro
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$(\textrm{BD})_{1/e^2}$ sul campione di circa \SI{130}{\um}.
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Per immettere i fasci di eccitazione nel cammino ottico che porta
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all'obiettivo si usa un dicroico di fluorescenza a tre bande,
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in grado di riflettere le tre lunghezze d'onda di eccitazione e
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trasmettere tre finestre di emissione nel quale ricadono i fluorofori
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più comunemenete eccitati a tali lunghezze d'onda.
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La fluorescenza riemessa all'indietro dal campione, e quindi trasmessa
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dal dicroico di fluorescenza, è combinata con l'illuminazione a luce
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trasmessa, da cui sarà disaccoppiata per mezzo di un successivo
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dicroico.
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Il percorso di raccolta dell'emissione di fluorescenza, infatti,
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condivide la stesse ottiche di ingrandimento con il percorso di
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raccolta della luce trasmessa e quindi lo stesso fattore di
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ingrandimento $\approx 225x$.
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Uno specchio dicroico passa-alto con frequenza di taglio di \SI{705}{\nm}
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viene utilizzato per estrarre l'emissione di fluorescenza dal
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cammino di raccolta e indirizzarla verso il sensore di una fotocamera
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di tipo \textit{Electron-Multiplying Charged Coupled Device (EmCCD)}.
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La regione attiva del sensore è di \SI{8.19x8.19}{\mm},
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corrispondente ad un quadrato di lato \SI{36}{\um} sul piano del campione.
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Il diametro
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del fascio di eccitazione, \SI{130}{\um},
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è significativamente maggiore di questo
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valore per massimizzare l'uniformità della potenza con la quale
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la regione di interesse viene illuminata.
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Dai calcoli eseguiti in seizone \ref{sec:single_molecule_fluorescence},
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per questi parametri risulta una variazione massima di intensità del
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17\% all'interno della regione.
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La camera usata per la rilevazione della fluorescenza è una ImagEM X2
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C9100-23B (Hamamatsu).
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Questo tipo di telecamera combina, al funzionamento tipico dei
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Charged-Coupled-Device (CCD), uno stadio di moltiplicazione degli
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elettroni, che consente di raggiungere, in presenza di raffreddamento
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a temperature inferiori ai -60°C, la sensibilità del singolo
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fotone. Maggiori dettagli sulla messa in opera del sistema di imaging
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sono forniti in sezione \ref{sec:single_molecule_fluorescence}.
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Per poter realizzare gli schemi di illuminazione HILO e TIRF è stato
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introdotto, nella parte terminale del percorso di eccitazione, prima
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del filtro dicroico, uno specchio mobile controllato elettronicamente.
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Azionando questo specchio è possibile ottenere uno spostamento
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orizzontale del fascio di eccitazione, e quindi, poiché esso
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attraverserà il piano focale posteriore dell'obiettivo in un punto
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diverso dal suo centro, si avrà una deflessione angolare del fascio di
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eccitazione in uscita dall'obiettivo.
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\begin{sidewaysfigure}
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\includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/setup.pdf}
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\caption{Vista d'insieme dell'apparato sperimentale}
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\label{fig:setup}
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|
\end{sidewaysfigure}
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\begin{sidewaystable}
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\centering
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\begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l}
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\toprule
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Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\
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\midrule
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\multicolumn{5}{l}{\it Percorso eccitazione fluorescenza}\\
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F-Clean635
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& Filtro passa-banda
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& Pulizia spettrale laser \SI{635}{\nm}
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& $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm},
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bw: \SI{14}{\nm}$
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& FF01-640/14-25\\
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L-TS1a
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|
& Lente sferica piano-convessa
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& Telescopio per laser a \SI{635}{\nm}
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& f: \SI{30}{\mm}
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& \\
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L-TS1b
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|
& &
|
|
& f: \SI{50}{\mm}
|
|
& \\
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|
L-TS2a
|
|
&
|
|
& Telescopio per laser a \SI{488}{\nm}
|
|
& f: \SI{30}{\mm}
|
|
& \\
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|
L-TS2b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{100}{\mm}
|
|
& \\
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|
DIC-532
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|
& Filtro dicroico single-edge
|
|
& Inserimento fascio a 532nm
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|
& $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$
|
|
& Di02-R532-25-D\\
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DIC-488
|
|
& & Inserimento fascio a 488nm
|
|
& $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$
|
|
& Di02-R488-25-D\\
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L-TS3a
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& Doppietto acromatico
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& Ingrandimento fasci fluorescenza
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& f: \SI{19}{\mm}
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& \\
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|
L-TS3b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{200}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-Exc
|
|
&
|
|
& Focalizzazione fascio fluorescenza
|
|
& f: \SI{500}{\mm}
|
|
& \\
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DIC-Fluor
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|
& Filtro dicroico quad-edge
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|
& Separazione eccitazione/emissione
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& $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$
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|
& Di03-R405/488/532/635-t1 \\
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|
\multicolumn{5}{l}{\it Percorso trappole}\\
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L-TS4a
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|
& Lente sferica piano-convessa
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& Inserimento laser 1064nm in isolatore.
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& %f: \SI{0}{\mm}
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|
& \\
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|
L-TS4b
|
|
& &
|
|
& %f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS5a
|
|
& Lente sferica piano-convessa
|
|
& Ingrandimento fascio 1064nm
|
|
& %f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS5b
|
|
& &
|
|
& %f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-Twz1
|
|
& Lente sferica piano-convessa
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|
& Ingrandimento rappole dopo AOD
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-Twz2
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
DIC-Twz1
|
|
& Lente sferica piano-convessa
|
|
& Inserimento fascio trappole
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|
& $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$
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|
& \\
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|
\multicolumn{5}{l}{\it Percorso Imaging}\\
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|
L-Im1
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|
& Tube Lens
|
|
& Tube Lens
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
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|
L-Im2
|
|
& Imaging Lens
|
|
& Imaging Lens
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
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|
DIC-BF
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|
& Filtro dicroico single-edge
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|
& Seprazione fluorescenza/brightfied
|
|
& $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$
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|
& FF705-Di01-25x36\\
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|
F-BlockBF
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|
& Filtro passa-basso
|
|
& Soppressione brightfield residuo
|
|
& $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$
|
|
& FESH0700\\
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|
F-Emiss
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|
& Filtro passa-banda quad-band
|
|
& Fluorofori/Soppressione laser eccitazione
|
|
& $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$
|
|
& FF01-446/510/581/703\\
|
|
F-BlockTwz
|
|
& Filtro band-stop
|
|
& Soppressione laser trappole residuo
|
|
& $\lambda_{centr}: 1064nm$
|
|
& \\
|
|
\end{tabular}
|
|
\caption{Lista delle componenti ottiche}
|
|
\label{tab:optical_components}
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|
\end{sidewaystable}
|
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