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@ -114,7 +114,7 @@ fluorofori liberi in soluzione.
Una soluzione tipicamente adottata prevede l'uso di schemi di
illuminazione come la riflessione interna totale
(TIRF, \textit{Total Interal Reflection Fluorescence microscopy})
(TIRF, \textit{Total Internal Reflection Fluorescence microscopy})
o i fogli di luce inclinati
(HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet
microscopy}),
@ -512,6 +512,7 @@ suo spostamento dalla posizione di riposo.
\section{Microscopia di fluorescenza di singola molecola}
\label{sec:fluo}
% come evitare ripetizione "singola(e) molecola(e)"
Tipicamente, le tecniche di microscopia di fluorescenza di singola
molecola consentono di sondare la posizione e i movimenti di singole
molecole con risoluzioni spaziali e temporali prossime,
@ -524,10 +525,10 @@ debole fluorescenza intrinseca, si fa quasi sempre ricorso alla
marcatura con fluorofori, cioè molecole con caratteristiche di
fluorescenza note e elevata resa quantica. In questo modo è
possibile ottenere livelli di segnale maggiori e soprattutto
una elevata specificità nel rendere rilevabili solo le molecole
un'elevata specificità nel rendere rilevabili solo le molecole
che presentano caratteristiche di interesse.
Queste due proprietà sono, come vedremo, molto importanti per
raggiungere un'elevata precisione di localizzazione.
raggiungere una buona precisione di localizzazione.
Le tecniche di microscopia di fluorescenza sono molto flessibili
e spesso non distruttive: consentono di osservare processi biologici
@ -563,7 +564,7 @@ regioni dello spettro visibile e con protocolli di marcatura
standardizzati. La scelta del fluoroforo e del protocollo di marcatura
devono tener conto di numerosi fattori, tra i quali: le condizioni
dell'esperimento (in vivo o in vitro), le possibili interferenze col
comportamento del sistema studiato, la compatibilità con le sostanza
comportamento del sistema studiato, la compatibilità con le sostanze
chimiche usate in soluzione, la stabilità del fluoroforo stesso e il
suo tempo di vita.
@ -586,19 +587,19 @@ a campo largo risiede in una più marcata soppressione del
rumore di fondo dovuto all'emissione di fluorescenza fuori dal
piano focale. I microscopi che sfruttano queste tecniche sono infatti
equipaggiati di opportuni accorgimenti per filtrare sia la radiazione
di eccitazione che quella raccolta in modo da selezionare uno strato
di eccitazione che quella raccolta, in modo da selezionare uno strato
estremamente sottile del volume del campione.
Le dimensioni del volume selezionato per ogni
punto acquisito posso avvicinarsi molto al limite di diffrazione, e
punto acquisito possono avvicinarsi molto al limite di diffrazione,
in questo modo è possibile visualizzare in maniera estremamente nitida
strutture con dettagli di dimensioni confrontabili con il limite
di diffrazione,
di diffrazione.
Lo svantaggio principale invece sta nella massima risoluzione
temporale ottenibile: per acquisire un'immagine è necessario
muovere il campione (o il fascio di illuminazione) attraverso
l'intero reticolo e per ogni punto è necessario un tempo di sosta
l'intero reticolo e per ogni punto è richiesto un tempo di sosta
adeguato a raccogliere un numero sufficiente di fotoni.
La risoluzione temporale di un microscopio a scansione quindi,
La risoluzione temporale di un microscopio a scansione, quindi,
decresce all'aumentare delle dimensioni dell'area osservata e della
densità di punti acquisita.
@ -610,19 +611,19 @@ dalla sensibilità del sensore usato e dalla velocità della sua scheda
elettronica.
Tuttavia, in questo caso, sul sensore si va a sommare all'immagine
proveniente dai fluorofori nel piano focale quella, fuori fuoco,
di tutti gli emettitori che si trovino su piani diversi attraversati
di tutti gli emettitori che si trovano su piani diversi attraversati
dal fascio.
In campioni con una elevata densità di fluorofori liberi in soluzione
questo effetto viene particolarmente accentuato, con un effetto
questo effetto viene particolarmente accentuato, con un impatto
negativo sul rapporto segnale/rumore ottenibile e di conseguenza
sulla possibilità di individuare e localizzare singole molecole.
Per ottenere una sensibilità di singola molecola senza scarificare
Per ottenere una sensibilità di singola molecola senza sacrificare
la risoluzione temporale sono state sviluppate tecniche che,
manipolando il fascio di eccitazione, consentono di ridurre lo
spessore del volume di campione eccitato, come la microscopia a
riflessione interna totale
(TIRF, \textit{Total Interal Reflection Fluorescence microscopy})
(TIRF, \textit{Total Internal Reflection Fluorescence microscopy})
o quella a fogli di luce inclinati
(HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet
microscopy}).


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