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@ -114,7 +114,7 @@ fluorofori liberi in soluzione. |
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Una soluzione tipicamente adottata prevede l'uso di schemi di |
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Una soluzione tipicamente adottata prevede l'uso di schemi di |
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illuminazione come la riflessione interna totale |
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illuminazione come la riflessione interna totale |
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(TIRF, \textit{Total Interal Reflection Fluorescence microscopy}) |
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(TIRF, \textit{Total Internal Reflection Fluorescence microscopy}) |
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o i fogli di luce inclinati |
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o i fogli di luce inclinati |
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(HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet |
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(HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet |
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microscopy}), |
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microscopy}), |
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@ -512,6 +512,7 @@ suo spostamento dalla posizione di riposo. |
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\section{Microscopia di fluorescenza di singola molecola} |
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\section{Microscopia di fluorescenza di singola molecola} |
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\label{sec:fluo} |
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\label{sec:fluo} |
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% come evitare ripetizione "singola(e) molecola(e)" |
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Tipicamente, le tecniche di microscopia di fluorescenza di singola |
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Tipicamente, le tecniche di microscopia di fluorescenza di singola |
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molecola consentono di sondare la posizione e i movimenti di singole |
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molecola consentono di sondare la posizione e i movimenti di singole |
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molecole con risoluzioni spaziali e temporali prossime, |
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molecole con risoluzioni spaziali e temporali prossime, |
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@ -524,10 +525,10 @@ debole fluorescenza intrinseca, si fa quasi sempre ricorso alla |
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marcatura con fluorofori, cioè molecole con caratteristiche di |
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marcatura con fluorofori, cioè molecole con caratteristiche di |
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fluorescenza note e elevata resa quantica. In questo modo è |
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fluorescenza note e elevata resa quantica. In questo modo è |
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possibile ottenere livelli di segnale maggiori e soprattutto |
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possibile ottenere livelli di segnale maggiori e soprattutto |
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una elevata specificità nel rendere rilevabili solo le molecole |
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un'elevata specificità nel rendere rilevabili solo le molecole |
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che presentano caratteristiche di interesse. |
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che presentano caratteristiche di interesse. |
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Queste due proprietà sono, come vedremo, molto importanti per |
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Queste due proprietà sono, come vedremo, molto importanti per |
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raggiungere un'elevata precisione di localizzazione. |
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raggiungere una buona precisione di localizzazione. |
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Le tecniche di microscopia di fluorescenza sono molto flessibili |
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Le tecniche di microscopia di fluorescenza sono molto flessibili |
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e spesso non distruttive: consentono di osservare processi biologici |
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e spesso non distruttive: consentono di osservare processi biologici |
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@ -563,7 +564,7 @@ regioni dello spettro visibile e con protocolli di marcatura |
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standardizzati. La scelta del fluoroforo e del protocollo di marcatura |
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standardizzati. La scelta del fluoroforo e del protocollo di marcatura |
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devono tener conto di numerosi fattori, tra i quali: le condizioni |
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devono tener conto di numerosi fattori, tra i quali: le condizioni |
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dell'esperimento (in vivo o in vitro), le possibili interferenze col |
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dell'esperimento (in vivo o in vitro), le possibili interferenze col |
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comportamento del sistema studiato, la compatibilità con le sostanza |
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comportamento del sistema studiato, la compatibilità con le sostanze |
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chimiche usate in soluzione, la stabilità del fluoroforo stesso e il |
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chimiche usate in soluzione, la stabilità del fluoroforo stesso e il |
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suo tempo di vita. |
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suo tempo di vita. |
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@ -586,19 +587,19 @@ a campo largo risiede in una più marcata soppressione del |
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rumore di fondo dovuto all'emissione di fluorescenza fuori dal |
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rumore di fondo dovuto all'emissione di fluorescenza fuori dal |
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piano focale. I microscopi che sfruttano queste tecniche sono infatti |
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piano focale. I microscopi che sfruttano queste tecniche sono infatti |
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equipaggiati di opportuni accorgimenti per filtrare sia la radiazione |
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equipaggiati di opportuni accorgimenti per filtrare sia la radiazione |
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di eccitazione che quella raccolta in modo da selezionare uno strato |
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di eccitazione che quella raccolta, in modo da selezionare uno strato |
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estremamente sottile del volume del campione. |
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estremamente sottile del volume del campione. |
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Le dimensioni del volume selezionato per ogni |
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Le dimensioni del volume selezionato per ogni |
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punto acquisito posso avvicinarsi molto al limite di diffrazione, e |
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punto acquisito possono avvicinarsi molto al limite di diffrazione, |
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in questo modo è possibile visualizzare in maniera estremamente nitida |
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in questo modo è possibile visualizzare in maniera estremamente nitida |
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strutture con dettagli di dimensioni confrontabili con il limite |
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strutture con dettagli di dimensioni confrontabili con il limite |
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di diffrazione, |
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di diffrazione. |
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Lo svantaggio principale invece sta nella massima risoluzione |
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Lo svantaggio principale invece sta nella massima risoluzione |
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temporale ottenibile: per acquisire un'immagine è necessario |
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temporale ottenibile: per acquisire un'immagine è necessario |
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muovere il campione (o il fascio di illuminazione) attraverso |
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muovere il campione (o il fascio di illuminazione) attraverso |
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l'intero reticolo e per ogni punto è necessario un tempo di sosta |
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l'intero reticolo e per ogni punto è richiesto un tempo di sosta |
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adeguato a raccogliere un numero sufficiente di fotoni. |
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adeguato a raccogliere un numero sufficiente di fotoni. |
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La risoluzione temporale di un microscopio a scansione quindi, |
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La risoluzione temporale di un microscopio a scansione, quindi, |
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decresce all'aumentare delle dimensioni dell'area osservata e della |
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decresce all'aumentare delle dimensioni dell'area osservata e della |
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densità di punti acquisita. |
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densità di punti acquisita. |
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@ -610,19 +611,19 @@ dalla sensibilità del sensore usato e dalla velocità della sua scheda |
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elettronica. |
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elettronica. |
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Tuttavia, in questo caso, sul sensore si va a sommare all'immagine |
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Tuttavia, in questo caso, sul sensore si va a sommare all'immagine |
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proveniente dai fluorofori nel piano focale quella, fuori fuoco, |
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proveniente dai fluorofori nel piano focale quella, fuori fuoco, |
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di tutti gli emettitori che si trovino su piani diversi attraversati |
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di tutti gli emettitori che si trovano su piani diversi attraversati |
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dal fascio. |
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dal fascio. |
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In campioni con una elevata densità di fluorofori liberi in soluzione |
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In campioni con una elevata densità di fluorofori liberi in soluzione |
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questo effetto viene particolarmente accentuato, con un effetto |
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questo effetto viene particolarmente accentuato, con un impatto |
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negativo sul rapporto segnale/rumore ottenibile e di conseguenza |
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negativo sul rapporto segnale/rumore ottenibile e di conseguenza |
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sulla possibilità di individuare e localizzare singole molecole. |
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sulla possibilità di individuare e localizzare singole molecole. |
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Per ottenere una sensibilità di singola molecola senza scarificare |
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Per ottenere una sensibilità di singola molecola senza sacrificare |
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la risoluzione temporale sono state sviluppate tecniche che, |
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la risoluzione temporale sono state sviluppate tecniche che, |
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manipolando il fascio di eccitazione, consentono di ridurre lo |
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manipolando il fascio di eccitazione, consentono di ridurre lo |
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spessore del volume di campione eccitato, come la microscopia a |
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spessore del volume di campione eccitato, come la microscopia a |
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riflessione interna totale |
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riflessione interna totale |
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(TIRF, \textit{Total Interal Reflection Fluorescence microscopy}) |
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(TIRF, \textit{Total Internal Reflection Fluorescence microscopy}) |
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o quella a fogli di luce inclinati |
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o quella a fogli di luce inclinati |
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(HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet |
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(HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet |
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microscopy}). |
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microscopy}). |
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