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- \chapter{Metodi}
- \label{cap:methods}
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- \section{Stabilizzazione meccanica}
- \label{sec:stabilization}
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- Nonostante l'isolamento meccanico fornito dagli
- elastomeri e dal tavolo ottico la posizione del campione
- rispetto al centro dell'obiettivo e la quota del piano
- focale sono soggette a fluttuazioni e derive.
- Gli effetti più evidenti e rilevabili sono rapide
- oscillazioni della posizione del campione dovute a
- vibrazioni acustiche residue e una progressive deriva
- rispetto alla posizione fissata che diventa significativa
- ($> \SI{100}{\nm}$) per tempi di osservazione di
- diversi minuti.
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- Per quantificare quest'effetto viene usato un apposito
- campione in cui diverse microsfere in silice, di diametro
- \SI{0.5}{\um}, vengono immobilizzate in uno strato di
- nitrocellulosa depositato nella superficie interna
- del vetrino coprioggetti. Le varie fasi per la
- preparazione di questo campione sono descritte nei
- particolari nell'appendice \ref{app:protocols} relativa
- ai protocolli, alla sezione
- \ref{sec:proto:silica_beads_flow}.
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- Le microsfere immobilizzate nel campione possono
- essere messe a fuoco e visualizzate attraverso il
- sistema di microscopia a luce trasmessa.
- Una volta selezionata e messa a fuoco una microsfera,
- analizzando l'immagine prodotta da uno dei due sensori
- CMOS è possibile calcolare le coordinate (in pixel)
- del suo centroide:
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- \begin{equation}
- (x_{cen}, y_{cen}) =
- \frac{
- \sum_{(x, y)} (x, y) I(x, y)
- }{
- \sum_{(x, y)} I(x, y)
- }
- \end{equation}
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- Per evitare di considerare altre microsfere o
- imperfezioni sul campione si sceglie di effettuare il
- calcolo del centroide limitando la regione dell'immagine
- utilizzata a un rettangolo nel quale una microsfera è
- sufficientemente isolata.
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- Ricalcolando il centroide intervalli temporali fissati
- è possibile osservare la deriva della posizione (x, y)
- della microsfera. Inoltre è possibile sfruttare questo
- stesso campione per effettuare una calibrazione del
- fattore di conversione pixel/nm lungo due assi
- ortogonali.
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- \section{Calibrazione parametri trappole}
- \label{sec:calibration}
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- \section{Retroazione AOM e \textit{force-clamp}}
- \label{sec:force-clamp}
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- \section{Saggio a tre sfere}
- \label{sec:three-beads}
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- \section{Fluorescenza di singola molecole}
- \label{sec:single_molecule_fluorescence}
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- \section{TIRF e illuminazione a modi di galleria}
- \label{sec:gallery_mode}
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