\chapter{Metodi}
\label{cap:methods}

 \section{Stabilizzazione meccanica}
 \label{sec:stabilization}
 
 Nonostante l'isolamento meccanico fornito dagli
 elastomeri e dal tavolo ottico la posizione del campione
 rispetto al centro dell'obiettivo e la quota del piano
 focale sono soggette a fluttuazioni e derive.
 Gli effetti più evidenti e rilevabili sono rapide
 oscillazioni della posizione del campione dovute a
 vibrazioni acustiche residue e una progressive deriva
 rispetto alla posizione fissata che diventa significativa
 ($> \SI{100}{\nm}$) per tempi di osservazione di
 diversi minuti.
 
 Per quantificare quest'effetto viene usato un apposito
 campione in cui diverse microsfere in silice, di diametro
 \SI{0.5}{\um}, vengono immobilizzate in uno strato di
 nitrocellulosa depositato nella superficie interna
 del vetrino coprioggetti. Le varie fasi per la
 preparazione di questo campione sono descritte nei
 particolari nell'appendice \ref{app:protocols} relativa
 ai protocolli, alla sezione
 \ref{sec:proto:silica_beads_flow}.
 
 Le microsfere immobilizzate nel campione possono
 essere messe a fuoco e visualizzate attraverso il 
 sistema di microscopia a luce trasmessa.
 Una volta selezionata e messa a fuoco una microsfera,
 analizzando l'immagine prodotta da uno dei due sensori
 CMOS è possibile calcolare le coordinate (in pixel)
 del suo centroide:
 
 \begin{equation}
     (x_{cen}, y_{cen}) =
        \frac{
            \sum_{(x, y)} (x, y) I(x, y)
        }{
            \sum_{(x, y)} I(x, y)
        }
 \end{equation}
 
 Per evitare di considerare altre microsfere o
 imperfezioni sul campione si sceglie di effettuare il
 calcolo del centroide limitando la regione dell'immagine
 utilizzata a un rettangolo nel quale una microsfera è
 sufficientemente isolata.
 
 Ricalcolando il centroide intervalli temporali fissati
 è possibile osservare la deriva della posizione (x, y)
 della microsfera. Inoltre è possibile sfruttare questo
 stesso campione per effettuare una calibrazione del
 fattore di conversione pixel/nm lungo due assi 
 ortogonali.

 
 
 \section{Calibrazione parametri trappole}
 \label{sec:calibration}
 
 \section{Retroazione AOM e \textit{force-clamp}}
 \label{sec:force-clamp}
 
 \section{Saggio a tre sfere}
 \label{sec:three-beads}
 
 \section{Fluorescenza di singola molecole}
 \label{sec:single_molecule_fluorescence}
 
 \section{TIRF e illuminazione a modi di galleria}
 \label{sec:gallery_mode}