%%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% \chapter{Apparato sperimentale} \label{cap:setup} L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopio invertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanica del LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistema di due pinzette ottiche posizionabili attraverso deflettori acusto-ottici e con uno schema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungere la sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemi di illuminazione (campo largo, TIRF, HILO). Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura \ref{fig:microscope}. %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e il funzionamento simultaneo - minimizzando le sovrapposizioni spettrali - dei tre principali schemi di microscopia e manipolazione: \begin{description} \item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una sorgente LED viene collimata da un condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso il campione. L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita dello stesso. \item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo, quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono essere usati per intrappolare e manipolare microsfere in soluzione. La radiazione laser che attraversa il campione e viene raccolta dal condensatore può essere analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo spostamento dal centro delle sfere intrappolate. \item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio di eccitazione. \end{description} \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf} \caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.} \label{fig:microscope} \end{figure} Per evitare interferenze è stato necessario scegliere opportune lunghezze d'onda per i tre schemi ottici e, di conseguenza, appropriati specchi dicroici e filtri. L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando una sorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm}, le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un laser a stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per la microscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgenti laser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} e l'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccolta e disaccoppiata dall'illuminazione a luce trasmessa. Tuttavia, la necessità di ottenere una sensibilità di singola molecola rende particolarmente critica la scelta delle caratteristiche spettrali e di qualità delle sorgenti e delle componenti ottiche utilizzate. In particolare, come vedremo nel dettaglio in sezione \ref{sec:stabilization}, la stabilizzazione meccanica del sistema richiede un’illuminazione a luce trasmessa del campione di intensità sufficiente a produrre una chiara immagine delle microsfere immobilizzate sui sensori CMOS. Allo stesso tempo, la microscopia di fluorescenza richiede la rilevazione di segnali estremamente deboli, attraverso un sensore di tipo EmCCD raffreddato estremamente sensibile. In questo contesto, anche il passaggio di pochi fotoni al secondo tra i due cammini ottici comprometterebbe la sensibilità del sistema. Per risolvere questo problema è state scelta una sorgente LED con un profilo di emissione sufficientemente lontano dalle lunghezze d’onda usate per la fluorescenza (400-700 nm) e il posizionamento di un filtro ad alta efficienza per per eliminare l’emissione residua del LED nella regione di sovrapposizione. Un altra serie di filtri ad altra efficienza è stata posta in prossimità del sensore EMCCD, procendendo anche alla completa separazione spaziale (attraverso tubi, diaframmi e separatori) del cammino ottico, in modo eliminare quasi completamente la componente di radiazione LED che raggiunge la camera. L’utilizzo di un LED con emissione centrata nel vicino infrarosso, con lunghezza d’onda sensibilmente più vicina al diametro delle microsfere utilizzate, ha inoltre effetti significativi sul profilo radiale di intensità delle immagini prodotte delle microsfere. Questa differenza, rispetto ai profili osservati con un illuminazione alle lunghezze d’onda del visibile, ha reso necessario lo sviluppo ex-novo di un algoritmo per la determinazione della posizione del piano focale rispetto al centro della sfera, descritto sempre in sezione \ref{sec:stabilization}. \section{Microscopio e traslatori} Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituiscono il microscopio sono assemblati su una struttura metallica personalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS. Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattro elastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuare significativamente le vibrazioni meccaniche. Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimento attraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa. Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarie per gli esperimenti viene caricata in una camera di reazione realizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti). Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraverso quattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore corto raggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il \textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}. Per gli scopi di questa tesi sono stati usati due obiettivi differenti: \begin{itemize} \item Un obiettivo planapocromatico 60x a immersione ad acqua, con alta apertura numerica ($NA = 1.22$) e distanza di lavoro di \SI{0.2}{\mm} (Nikon) \item Un obiettivo TIRF 60x a immersione a olio, con alta apertura numerica ($NA = 1.49$) e distanza di lavoro di \SI{0.13}{\mm} (Nikon). \end{itemize} Il primo obiettivo presenta le caratteristiche migliori per quanto riguarda l'efficienza delle pinzette ottiche, anche a profondità significative all'interno del campione. Il secondo obiettivo invece permette la realizzazione di schemi di illuminazione TIRF, al prezzo di un'efficienza delle pinzette ottiche che decresce rapidamente all'aumentare del volume di campione attraversato. La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico può essere modificata attraverso due traslatori controllati elettronicamente, uno, il traslatore a corto raggio, di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, P-527) per spostamenti veloci e con risoluzione di \SI{1}{\nm}, con una corsa di \SI{100}{\um} per asse, e l'altro, il translatore a lungo raggio, dotato di un motore piezoelettrico (Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI{50}{\mm} per asse e risoluzioni di \SI{100}{\nm}. Il piano focale può essere modificato variando la posizione dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico (Physik Instrumente, PIFOC™ P-725) con con una corsa di \SI{400}{\um} e risoluzione di \SI{2}{\nm}. Il microscopio è stato progettato in modo che al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenza della superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campione preparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti). I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivo sono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente E-517 e E-665) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in modalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungo raggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito da Galil Motion Control e equipaggiati di un \textit{encoder} che permette la selezione e il monitoraggio della velocità di spostamento. Le tre unità di controllo sono connesse ad un PC mediante interfaccia seriale RS232 e possono essere programmate e controllate usando i protocolli di comunicazione GCS per i moduli Physik Instrumente e GC \cite{gclib} per il modulo Galil Motion Control. Per semplificare l'utilizzo dei tre gli attuatori durante la manipolazione di un campione è stato programma in ambiente LabVIEW che implementa i protocolli di comunicazione richiesti (\texttt{Joystick Control}). In particolare il codice sviluppato consente di utilizzare levette analogiche e cursori di un \textit{controller} della console Xbox 360 (Microsoft) per inviare comandi agli attuatori, rendendo la manipolazione del campione particolarmente semplice e intuitiva. \section{Illuminazione a luce trasmessa} La radiazione emessa da un LED ad alta intensità (Thorlabs, M780L3) con picco di emissione centrato nell'infrarosso, a \SI{780}{nm}, viene filtrata con un filtro passa-basso (Thorlabs, FEHL0750) in modo da sopprimere l'emissione a lunghezze d'onda inferiori a \SI{750}{nm} che andrebbe a interferire con il rilevamento della fluorescenza. Successivamente, con l'ausilio di una singola lente e un accoppiatore in fibra (Thorlabs), la radiazione emessa dal LED e filtrata viene immessa in una fibra ottica e trasportata in corrispondenza del microscopio. All'altra estremità della fibra, in basso a destra nello schema ottico mostrato in figura \ref{fig:setup}, un sistema formato da un collimatore, un diaframma e una lente (\texttt{L-BF} nello schema) aggiusta le dimensioni e la divergenza del fascio di illuminazione, focalizzandolo sul piano focale posteriore del condensatore. Il fascio di illuminazione collimato illumina il campione, lo attraversa e la radiazione trasmessa e diffusa viene raccolta dall'obiettivo. Gli obiettivi usati sono corretti all'infinito, questo significa che le aberrazioni sono corrette quando il campione è posto sul piano focale anteriore dell'obiettivo e i raggi provenienti da tale piano e in uscita dall'obiettivo sono collimati. Inserendo nel percorso ottico una \textit{tube lens} (\texttt{L-Im1}), posta dopo il dicroico di fluorescenza (\texttt{DIC-Fluor}), l'immagine viene quindi formata sul piano focale (\texttt{Image plane}) della stessa lente. La distanza focale dell'obiettivo è di \SI{3.3}{\mm}, quella della \textit{tube lens} di \SI{250}{\mm}. Otteniamo quindi la formazione di un'immagine del piano del campione selezionato a una distanza di \SI{250}{\mm} dalla lente e con un fattore di ingrandimento $M = 250/3.3 \approx 75$. Questa immagine viene ulteriormente ingrandita mediante l'uso di un'ulteriore lente (\texttt{L-Im2}) con distanza focale \SI{75}{\mm} posta a \SI{350}{mm} dalla lente di tubo. In questo modo si ottiene, a una distanza di \SI{30}{\cm} dall'ultima lente, un ulteriore ingrandimento di un fattore $M' = 300 / (350-250) = 3$. A questa distanza l'immagine viene rilevata, dopo aver diviso il cammino ottico in due rami con un \textit{beam-splitter} (\texttt{BS-BF}), da due sensori CMOS monocromatici (Thorlabs DCC1545M). La potenza viene suddivisa tra i due sensori secondo il rapporto 90:10. Il sensore che riceve la frazione maggiore di potenza sarà utilizzato per il sistema attivo di stabilizzazione meccanica (descritto in sezione \ref{sec:stabilization}), dopo aver filtrato la radiazione residua a \SI{1064}{\nm} con un apposito filtro (\texttt{F-BlockTwz}); l'altro sensore verrà utilizzato per mostrare costantemente su un monitor l'immagine del campione. I sensori CMOS usati hanno una risoluzione di \SI{1280x1024}{pixel} e un'area attiva di \SI{6.66x5.32}{\mm}, corrispondenti a una dimensione di \SI{5.2x5.2}{\um} per ogni pixel. La velocità di acquisizione è di \SI{30}{fps} per l'intera superficie del sesnore, ma è possibile incrementarla riducendo la dimensione della regione d'interesse. Tenendo conto del fattore complessivo di ingrandimento ($75\times 3 = 225$) un'immagine completa corrisponde a una regione del campione \SI{30x24}{\um}, la dimensione di un singolo pixel corrisponde invece ad un quadrato di lato \SI{23}{\nm} sul campione. I valori corretti possono essere determinati solo sperimentalmente dopo aver fissato l'allineamento del percorso ottico e delle telecamere. Per ottenere i fattori reali di conversione tra pixel e dimensioni sul campione ho sviluppato un programma in ampiente LabVIEW che, sfruttando una microsfera immobilizzata sul vetrino portaoggetti, consente di eseguire una calibrazione assistita (sezione \ref{sec:stabilization}). \section{Pinzette ottiche} \label{sec:tweezer} Il fascio \textit{laser} collimato in uscita da una sorgente \ce{Nd}:\ce{YVO4}, in alto a destra nello schema di figura \ref{fig:setup}, dopo essere stato ridotto in diametro grazie a un telescopio (lenti \texttt{L-TS4a} e \texttt{L-TS4b}), attraversa immediatamente una serie di due isolatori ottici, necessari per ridurre al minimo le instabilità della sorgente dovute alla retro-riflessione, e viene nuovamente ingrandito con un secondo telescopio (lenti \texttt{L-TS5a} e \texttt{L-TS5b}). Successivamente, dopo aver attraversato una lamina $\lambda/2$, viene diviso da un \textit{beam splitter} polarizzatore (\texttt{BS-Twz1}) in due fasci ortogonali. I due fasci avranno polarizzazioni parallele o perpendicolari rispetto alla superficie del tavolo ottico, e la lamina $\lambda/2$ consente di modificare la ripartizione di potenza tra i due rami. I due rami vengono ricombinati utilizzando un secondo cubo polarizzatore (\texttt{BS-Twz2}), dopo aver attraversato due deflettori acusto-ottici (\textit{Acousto Optic Deflector, AOD}). Gli AOD vengono realizzati ponendo un cristallo di diossido di tellurio (\ce{TeO2}) in contatto con un trasduttore piezoelettrico: la radiofrequenza trasmessa al trasduttore consente l'instaurazione di un onda stazionaria acustica all'interno del cristallo, che si comporta sostanzialmente come un reticolo di diffrazione. Variando l'ampiezza e la frequenza del segnale elettrico inviato agli AOD è possibile modificare le caratteristiche dell'onda acustica stazionaria nel cristallo, e quindi ottenere una deflessiondel fascio in uscita. Gli elementi ottici sono allineati in modo che quando a entrambi gli AOD viene applicato un segnale di \SI{75}{MHz} i due rami incidano perpendicolarmente sull'ultimo cubo polarizzatore e proseguano il loro percorso esattamente sovrapposti (linea continua nella figura \ref{fig:aom}). \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=\linewidth]{images/aom.pdf} \caption{Schema per la realizzazione di due pinzette ottiche indipendenti.} \label{fig:aom} \end{figure} Una coppia di lenti piano-convesse incrementa la dimensione del fascio e rende il piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il piano delle uscite degli AOD. In questo modo, per qualsiasi deflessione angolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappole passeranno sempre collimati per il centro del piano focale posteriore dell'obiettivo, con angolo d'incidenza dipendente dalla radiofrequenza applicata. I fasci, quindi, attraversano l'obiettivo e vengono focalizzati dentro il campione propagandosi parallelamente all'asse ottico principale. La variazione di angolo di incidenza nel piano focale posteriore dell'obiettivo si tradue in uno spostamento orizzontale dei fasci nel piano del campione: in questo modo, regolando la radiofrequenza degli AOD è possibile spostare la posizione delle trappole lungo una linea orizzontale all'interno del campione. I fattori di conversione tra posizione della trappola nel campione e frequenza inviata all'AOD, determinati dalle caratteristiche degli AOD e dalla geometria del sistema ottico, vengono determinati a posteriori visualizzando microsfere intrappolate e creando rette di calibrazione (vedi sezione \ref{sec:calibration}). I deflettori acusto-ottici utilizzati (AA Opto-Electronic, DTSXY-250) sfruttano onde acustiche di taglio, in cui la velocità di propagazione dell'onda è perpendicolare al fascio in ingresso; in questo modo i nodi dell'onda stazionaria si dispongono lungo un asse parallela al banco ottico. Questo tipo di deflettori richiedono una polarizzazione in ingresso lineare e perpendicolare all'onda acustica e producono in uscita un fascio con polarizzazione ortogonale rispetto a quella in ingresso. Per questo nel percorso ottico vengono aggiunte due ulteriori lamine $\lambda / 2$: una permette di aver per entrambi gli AOD la stessa polarizzazione in ingresso, la seconda ruota nuovamente di \SI{90}{\degree} la polarizzazione di uno dei due fasci in modo che abbiano polarizzazione ortogonali prima di ricombinarsi. L'intervallo di scansione angolare consentito da questi AOD è di circa \SI{2.8}{\degree}, corrispondenti a variazioni di \SI{50}{\MHz} nella radiofrequenza fornita. Lungo questo intervallo l'efficienza dell'AOD, ovvero la frazione di fascio deflessa nel primo ordine di diffrazione, può variare significativamente. Questa dipendenza può essere nociva per gli esperimenti con le pinzette ottiche: se l'intensità dei fasci non è uniforme per tutte le posizioni della trappola, la costante elastica della pinzetta ottica varierà durante gli spostamenti, rendendo difficile la manipolazione del campione attraverso lunghe distanze e potenzialmente falsando i risultati degli esperimenti. Variando l'angolo di incidenza del fascio rispetto all'AOD è possibile ottimizzare questa dipendenza intorno a un intervallo di deflessioni angolari di nostro interesse. Resta comunque una variazione non trascurabile della rigidità delle trappole in funzione della posizione e per tenerne conto si utilizza un'apposita procedura di calibrazione in cui la rigidità viene misurata osservando la diffusione di una microsfera nella trappola, per una griglia equispaziata di punti (procedura descritta in sezione \ref{sec:calibration}). Per poter osservare e registrare gli spostamenti delle microsfere nella trappole così realizzate è stato implementato un sistema di rilevamento della radiazione nel piano focale posteriore del condensatore (\textit{back-focal plane detection}, BFPD). \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=\linewidth]{images/bfp.pdf} \caption{Principio di funzionamento della \textit{back-focal-plane detection} e andamento della sensibilità al variare della dimensione dello \textit{spot}} \label{fig:bfp} \end{figure} Il profilo d'intensità della luce diffusa in avanti da una microsfera in una trappola ottica, rilevato nel piano focale posteriore, permette di conoscere la posizione relativa della microsfera rispetto al centro della trappola, senza dipendere (in condizioni ideali) dalla posizione assoluta della trappola nel campione. Per sfruttare questa proprietà la radiazione a \SI{1064}{\nm} è estratta dal cammino ottico successivo al condensatore grazie ad uno specchio dicroico. Successivamente le due polarizzazioni, corrispondenti alle due trappole, vengono separate da un cubo polarizzatore, e inviate rispettivamente a due fotodiodi a quadranti (\textit{Quadrant Photodiode Detector, QPD}), posizionati in un piano coniugato con il piano focale posteriore del condensatore. In questo piano la distribuzione spaziale del campo elettrico è data dalla trasformata di Fourier del campo in corrispondenza del piano del campione messo a fuoco. È possibile dimostrare che nel caso di una sfera spostata rispetto al centro della trappola l'asimmetria del profilo d'intensità nel piano focale posteriore sarà direttamente proporzionale allo spostamento della sfera rispetto al centro della trappola. Grazie ai due QPD possiamo quindi quantificare l'asimmetria del profilo d'intensità della radiazione diffusa in avanti lungo due assi ortogonali, ottenendo letture proporzionali agli spostamenti relativi della microsfera. Queste letture vengono prodotte da un sistema di amplificatori differenziali che opera sui quattro quadranti, producendo in uscita segnali la cui tensione, dopo opportuna calibrazione, può essere messa in relazione allo spostamento della microsfera. \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=\textwidth]{images/qpd.pdf} \caption{Schema per la rilevazione della posizione relativa della microsfera.} \label{fig:qpd} \end{figure} Maggiori dettagli sull'elettronica che consente il controllo della deflessione attraverso gli AOD e la lettura del segnale dei QPD sono forniti nell'appendice \ref{app:electronics}, mentre le procedure di calibrazione sono trattate nella sezione \ref{sec:calibration}. \section{Fluorescenza} Il percorso di eccitazione per la microscopia di fluorescenza è realizzato a partire da tre sorgenti \textit{laser}: \begin{itemize} \item \textbf{\SI[detect-weight = true]{488}{\nm}:} Cobolt MLD™ 488, con potenza regolabile tra \SIlist{0;60}{\mW} attraverso programma di controllo. \item \textbf{\SI[detect-weight = true]{532}{\nm}:} Coherent Sapphire, con potenza regolabile tra \SIlist{0;200}{\mW} attraverso manopola di controllo. \item \textbf{\SI[detect-weight = true]{635}{\nm}:} Blue Sky Research FTEC-2-635, con potenza regolabile tra \SIlist{0;60}{mW} attraverso modulazione analogica in tensione. \end{itemize} Le tre sorgenti si trovano fuori dal tavolo ottico e la radiazione viene trasportata attraverso tre fibre ottiche. Sul tavolo ottico la radiazione viene emessa nello spazio libero tramite tre collimatori con specifiche diverse. \begin{table}[ht] \centering \begin{tabular}{c c c c} \toprule $\lambda [\si{\nm}]$ & f [\si{\mm}] & $(\textrm{BD})_{1/e^2} ~[\si{\mm}]$ & M\\ \midrule 488 & 4 & 0.49 & 3.33x\\ 532 & 11 & 1.57 &\\ 635 & 6 & 1.07 & 1.66x\\ \bottomrule \end{tabular} \caption{Collimatori usati per estrarre i fasci alle varie lunghezzed d'onda, con distanza focale indicata dal costruttore (f) e diametro del fascio (BD) misurato mediante \textit{fit} gaussiano del suo profilo d'intensità. Nella colonna M è riportato il fattore d'ingrandimento che abbiamo selezionato per ottenere fasci con dimensioni consistenti, attraverso l'utilizzo di telescopi.} \label{tab:my_label} \end{table} I fasci a \SIlist{488;635}{\nm} vengono ingranditi mediante due telescopi realizzati con lenti piano-convesse, in questo modo si ottengono dimensioni del fascio, e quindi caratteristiche di uniformità nell'illuminazione del campione, confrontabili e simili per tutte le lunghezze d'onda usate. Per il fascio a 635 nm si ottiene un fattore d’ingrandimento di 1.66x utilizzando le lenti \texttt{L-TS1a} e \texttt{L-TS1b}, per quello a \SI{488}{\nm} un fattore d’ingrandimento 3.33x utilizzando le lenti \texttt{L-TS2a} e \texttt{L-TS2b}. L'emissione dei laser a diodo deve essere filtrata attraverso filtri passa-banda stretti per evitare che radiazione a lunghezze d'onda spurie diffonda nel campione e contamini l'emissione di fluorescenza. I tre fasci laser vengono combinati in un unico percorso ottico attraverso due specchi dicroici (uno ottimizzato per riflettere il 90\% della radiazione a lunghezze d'onda inferiori ai 532 nm, \texttt{DIC-532}, e l'altro per riflettere il 90\% di quelle inferiori a 488 nm, \texttt{DIC-488}). Successivamente il fascio con le tre lunghezze d'onda combinate viene ingrandito di un fattore 10x per mezzo di un ulteriore telescopio sul percorso comune, formato dalle lenti \texttt{L-TS3a} e \texttt{L-TS3b}, raggiungendo un diametro $\approx \SI{2}{\cm}$. I fasci combinati sono focalizzati sul piano focale posteriore dell'obiettivo da una lente con focale $f = \SI{500}{\mm}$, ottenendo, in combinazione con uno dei due obiettivi di focale \SI{3.3}{\mm}, un fattore di scala di circa $1/150$ e quindi un diametro $(\textrm{BD})_{1/e^2}$ sul campione di circa \SI{130}{\um}. Per immettere i fasci di eccitazione nel cammino ottico che porta all'obiettivo si usa un dicroico di fluorescenza a tre bande, in grado di riflettere le tre lunghezze d'onda di eccitazione e trasmettere tre finestre di emissione nel quale ricadono i fluorofori più comunemenete eccitati a tali lunghezze d'onda. La fluorescenza riemessa all'indietro dal campione, e quindi trasmessa dal dicroico di fluorescenza, è combinata con l'illuminazione a luce trasmessa, da cui sarà disaccoppiata per mezzo di un successivo dicroico. Il percorso di raccolta dell'emissione di fluorescenza, infatti, condivide la stesse ottiche di ingrandimento con il percorso di raccolta della luce trasmessa e quindi lo stesso fattore di ingrandimento $\approx 225x$. Uno specchio dicroico passa-alto con frequenza di taglio di \SI{705}{\nm} viene utilizzato per estrarre l'emissione di fluorescenza dal cammino di raccolta e indirizzarla verso il sensore di una fotocamera di tipo \textit{Electron-Multiplying Charged Coupled Device (EmCCD)}. La regione attiva del sensore è di \SI{8.19x8.19}{\mm}, corrispondente ad un quadrato di lato \SI{36}{\um} sul piano del campione. Il diametro del fascio di eccitazione, \SI{130}{\um}, è significativamente maggiore di questo valore per massimizzare l'uniformità della potenza con la quale la regione di interesse viene illuminata. Dai calcoli eseguiti in seizone \ref{sec:single_molecule_fluorescence}, per questi parametri risulta una variazione massima di intensità del 17\% all'interno della regione. La camera usata per la rilevazione della fluorescenza è una ImagEM X2 C9100-23B (Hamamatsu). Questo tipo di telecamera combina, al funzionamento tipico dei Charged-Coupled-Device (CCD), uno stadio di moltiplicazione degli elettroni, che consente di raggiungere, in presenza di raffreddamento a temperature inferiori ai -60°C, la sensibilità del singolo fotone. Maggiori dettagli sulla messa in opera del sistema di imaging sono forniti in sezione \ref{sec:single_molecule_fluorescence}. Per poter realizzare gli schemi di illuminazione HILO e TIRF è stato introdotto, nella parte terminale del percorso di eccitazione, prima del filtro dicroico, uno specchio mobile controllato elettronicamente. Azionando questo specchio è possibile ottenere uno spostamento orizzontale del fascio di eccitazione, e quindi, poiché esso attraverserà il piano focale posteriore dell'obiettivo in un punto diverso dal suo centro, si avrà una deflessione angolare del fascio di eccitazione in uscita dall'obiettivo. \begin{sidewaysfigure} \includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/setup.pdf} \caption{Vista d'insieme dell'apparato sperimentale} \label{fig:setup} \end{sidewaysfigure} \begin{sidewaystable} \centering \begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l} \toprule Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\ \midrule \multicolumn{5}{l}{\it Percorso eccitazione fluorescenza}\\ F-Clean635 & Filtro passa-banda & Pulizia spettrale laser \SI{635}{\nm} & $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm}, bw: \SI{14}{\nm}$ & FF01-640/14-25\\ L-TS1a & Lente sferica piano-convessa & Telescopio per laser a \SI{635}{\nm} & f: \SI{30}{\mm} & \\ L-TS1b & & & f: \SI{50}{\mm} & \\ L-TS2a & & Telescopio per laser a \SI{488}{\nm} & f: \SI{30}{\mm} & \\ L-TS2b & & & f: \SI{100}{\mm} & \\ DIC-532 & Filtro dicroico single-edge & Inserimento fascio a 532nm & $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$ & Di02-R532-25-D\\ DIC-488 & & Inserimento fascio a 488nm & $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$ & Di02-R488-25-D\\ L-TS3a & Doppietto acromatico & Ingrandimento fasci fluorescenza & f: \SI{19}{\mm} & \\ L-TS3b & & & f: \SI{200}{\mm} & \\ L-Exc & & Focalizzazione fascio fluorescenza & f: \SI{500}{\mm} & \\ DIC-Fluor & Filtro dicroico quad-edge & Separazione eccitazione/emissione & $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$ & Di03-R405/488/532/635-t1 \\ \multicolumn{5}{l}{\it Percorso trappole}\\ L-TS4a & Lente sferica piano-convessa & Inserimento laser 1064nm in isolatore. & %f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS4b & & & %f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS5a & Lente sferica piano-convessa & Ingrandimento fascio 1064nm & %f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS5b & & & %f: \SI{0}{\mm} & \\ L-Twz1 & Lente sferica piano-convessa & Ingrandimento rappole dopo AOD & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-Twz2 & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ DIC-Twz1 & Lente sferica piano-convessa & Inserimento fascio trappole & $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$ & \\ \multicolumn{5}{l}{\it Percorso Imaging}\\ L-Im1 & Tube Lens & Tube Lens & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-Im2 & Imaging Lens & Imaging Lens & f: \SI{0}{\mm} & \\ DIC-BF & Filtro dicroico single-edge & Seprazione fluorescenza/brightfied & $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$ & FF705-Di01-25x36\\ F-BlockBF & Filtro passa-basso & Soppressione brightfield residuo & $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$ & FESH0700\\ F-Emiss & Filtro passa-banda quad-band & Fluorofori/Soppressione laser eccitazione & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$ & FF01-446/510/581/703\\ F-BlockTwz & Filtro band-stop & Soppressione laser trappole residuo & $\lambda_{centr}: 1064nm$ & \\ \end{tabular} \caption{Lista delle componenti ottiche} \label{tab:optical_components} \end{sidewaystable}