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\chapter{Apparato sperimentale}
\label{cap:setup}

L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopio
invertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanica
del LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistema
di due pinzette ottiche posizionabili attraverso deflettori acusto-ottici
e con uno
schema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungere
la sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemi
di illuminazione (campo largo, TIRF, HILO).

Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura
\ref{fig:microscope}.


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Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e il
funzionamento simultaneo - minimizzando le sovrapposizioni
spettrali - dei tre principali
schemi di microscopia e manipolazione:

\begin{description}
    \item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una
        sorgente LED viene collimata da un
        condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso
        il campione.
        L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce
        trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita dello stesso.
    \item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono
        collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo,
        quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono
        essere usati per intrappolare e manipolare microsfere
        in soluzione. La radiazione laser che attraversa
        il campione e viene raccolta dal condensatore può essere
        analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo
        spostamento dal centro delle sfere intrappolate.
    \item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene
        focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e
        quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La
        radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione
        viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso
        un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio
        di eccitazione.
\end{description}

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf}
    \caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi
    ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.}
    \label{fig:microscope}
\end{figure}

Per evitare interferenze è stato necessario
scegliere opportune lunghezze d'onda per i tre schemi ottici
e, di conseguenza, appropriati specchi dicroici
e filtri.

L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando una
sorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm},
le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un laser
a stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per la
microscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgenti
laser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} e
l'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccolta
e disaccoppiata dall'illuminazione a luce trasmessa.

Tuttavia, la necessità di ottenere una sensibilità di singola molecola
rende particolarmente critica la scelta delle caratteristiche
spettrali e di qualità delle sorgenti e delle componenti ottiche
utilizzate. In particolare, come vedremo nel dettaglio in sezione
\ref{sec:stabilization}, la stabilizzazione meccanica del sistema
richiede un’illuminazione a luce trasmessa del campione di intensità
sufficiente a produrre una chiara immagine delle microsfere
immobilizzate sui sensori CMOS.  Allo stesso tempo, la microscopia di
fluorescenza richiede la rilevazione di segnali estremamente deboli,
attraverso un sensore di tipo EmCCD raffreddato estremamente
sensibile. In questo contesto, anche il passaggio di pochi fotoni al
secondo tra i due cammini ottici comprometterebbe la sensibilità del
sistema. Per risolvere questo problema è state scelta una sorgente LED
con un profilo di emissione sufficientemente lontano dalle lunghezze
d’onda usate per la fluorescenza (400-700 nm) e il posizionamento di
un filtro ad alta efficienza per per eliminare l’emissione residua del
LED nella regione di sovrapposizione. Un altra serie di filtri ad
altra efficienza è stata posta in prossimità del sensore EMCCD,
procendendo anche alla completa separazione spaziale (attraverso tubi,
diaframmi e separatori) del cammino ottico, in modo eliminare quasi
completamente la componente di radiazione LED che raggiunge la
camera. L’utilizzo di un LED con emissione centrata nel vicino
infrarosso, con lunghezza d’onda sensibilmente più vicina al diametro
delle microsfere utilizzate, ha inoltre effetti significativi sul
profilo radiale di intensità delle immagini prodotte delle
microsfere. Questa differenza, rispetto ai profili osservati con un
illuminazione alle lunghezze d’onda del visibile, ha reso necessario
lo sviluppo ex-novo di un algoritmo per la determinazione della
posizione del piano focale rispetto al centro della sfera, descritto
sempre in sezione \ref{sec:stabilization}.


\section{Microscopio e traslatori}

Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituiscono
il microscopio sono assemblati su una struttura metallica
personalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS.
Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattro
elastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuare
significativamente le vibrazioni meccaniche.
Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimento
attraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa.

Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarie
per gli esperimenti viene caricata in una camera di reazione
realizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti).
Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraverso
quattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore corto
raggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il 
\textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}.

Per gli scopi di questa tesi sono stati usati due obiettivi
differenti:

\begin{itemize}
    \item Un obiettivo planapocromatico 60x a immersione ad acqua, con
      alta apertura numerica ($NA = 1.22$) e distanza di lavoro di
      \SI{0.2}{\mm} (Nikon)
    \item Un obiettivo TIRF 60x a immersione a olio, con alta apertura
      numerica ($NA = 1.49$) e distanza di lavoro di \SI{0.13}{\mm}
      (Nikon).
\end{itemize}

Il primo obiettivo presenta le caratteristiche migliori per quanto
riguarda l'efficienza delle pinzette ottiche, anche a profondità
significative all'interno del campione.
Il secondo obiettivo invece permette la realizzazione di schemi di
illuminazione TIRF, al prezzo di un'efficienza delle pinzette ottiche
che decresce rapidamente all'aumentare del volume di campione
attraversato.

La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico può
essere modificata attraverso due traslatori controllati
elettronicamente, uno, il traslatore a corto raggio, di tipo
piezoelettrico (Physik Instrumente, P-527) per spostamenti veloci e
con risoluzione di \SI{1}{\nm}, con una corsa di \SI{100}{\um} per
asse, e l'altro, il translatore a lungo raggio, dotato di un motore
piezoelettrico (Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con
una corsa di \SI{50}{\mm} per asse e risoluzioni di \SI{100}{\nm}.

Il piano focale può essere modificato variando la posizione
dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico
(Physik Instrumente, PIFOC™ P-725) con con una corsa di \SI{400}{\um}
e risoluzione di \SI{2}{\nm}. Il microscopio è stato progettato in modo
che al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenza
della superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campione
preparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti).

I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivo
sono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente
E-517 e E-665) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in
modalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungo
raggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito da
Galil Motion Control e equipaggiati di un \textit{encoder} che
permette la selezione e il monitoraggio della velocità di spostamento.
Le tre unità di controllo sono connesse ad un PC mediante interfaccia
seriale RS232 e possono essere programmate e controllate usando
i protocolli di comunicazione GCS per i moduli Physik Instrumente
e GC \cite{gclib} per il modulo Galil Motion Control.

Per semplificare l'utilizzo dei tre gli attuatori durante
la manipolazione di un campione è stato programma
in ambiente LabVIEW che implementa i protocolli di comunicazione
richiesti (\texttt{Joystick Control}).
In particolare il codice sviluppato consente di utilizzare
levette analogiche e cursori di un \textit{controller} della console
Xbox 360 (Microsoft) per inviare comandi agli attuatori, rendendo la
manipolazione del campione particolarmente semplice e intuitiva.

\section{Illuminazione a luce trasmessa}

La radiazione emessa da un LED ad alta intensità (Thorlabs, M780L3)
con picco di emissione centrato nell'infrarosso, a \SI{780}{nm}, viene
filtrata con un filtro passa-basso (Thorlabs, FEHL0750) in modo da
sopprimere l'emissione a lunghezze d'onda inferiori a \SI{750}{nm} che
andrebbe a interferire con il rilevamento della fluorescenza.
Successivamente, con l'ausilio di una singola lente e un accoppiatore
in fibra (Thorlabs), la radiazione emessa dal LED e filtrata viene
immessa in una fibra ottica e trasportata in corrispondenza del
microscopio. All'altra estremità della fibra, in basso a destra nello
schema ottico mostrato in figura \ref{fig:setup}, un sistema formato
da un collimatore, un diaframma e una lente (\texttt{L-BF} nello
schema) aggiusta le dimensioni e la divergenza del fascio di
illuminazione, focalizzandolo sul piano focale posteriore del
condensatore.  Il fascio di illuminazione collimato illumina il
campione, lo attraversa e la radiazione trasmessa e diffusa viene
raccolta dall'obiettivo.  Gli obiettivi usati sono corretti
all'infinito, questo significa che le aberrazioni sono corrette quando
il campione è posto sul piano focale anteriore dell'obiettivo e i
raggi provenienti da tale piano e in uscita dall'obiettivo sono
collimati.  Inserendo nel percorso ottico una \textit{tube lens}
(\texttt{L-Im1}), posta dopo il dicroico di fluorescenza
(\texttt{DIC-Fluor}), l'immagine viene quindi formata sul piano focale
(\texttt{Image plane}) della stessa lente.  La distanza focale
dell'obiettivo è di \SI{3.3}{\mm}, quella della \textit{tube lens} di
\SI{250}{\mm}.  Otteniamo quindi la formazione di un'immagine del
piano del campione selezionato a una distanza di \SI{250}{\mm} dalla
lente e con un fattore di ingrandimento $M = 250/3.3 \approx 75$.
Questa immagine viene ulteriormente ingrandita mediante l'uso di
un'ulteriore lente (\texttt{L-Im2}) con distanza focale \SI{75}{\mm}
posta a \SI{350}{mm} dalla lente di tubo.  In questo modo si ottiene,
a una distanza di \SI{30}{\cm} dall'ultima lente, un ulteriore
ingrandimento di un fattore $M' = 300 / (350-250) = 3$.  A questa
distanza l'immagine viene rilevata, dopo aver diviso il cammino ottico
in due rami con un \textit{beam-splitter} (\texttt{BS-BF}), da due
sensori CMOS monocromatici (Thorlabs DCC1545M).  La potenza viene
suddivisa tra i due sensori secondo il rapporto 90:10. Il sensore che
riceve la frazione maggiore di potenza sarà utilizzato per il sistema
attivo di stabilizzazione meccanica (descritto in sezione
\ref{sec:stabilization}), dopo aver filtrato la radiazione residua a
\SI{1064}{\nm} con un apposito filtro (\texttt{F-BlockTwz}); l'altro
sensore verrà utilizzato per mostrare costantemente su un monitor
l'immagine del campione.

I sensori CMOS usati hanno una risoluzione di \SI{1280x1024}{pixel} e
un'area attiva di \SI{6.66x5.32}{\mm}, corrispondenti a una dimensione
di \SI{5.2x5.2}{\um} per ogni pixel. La velocità di acquisizione è di
\SI{30}{fps} per l'intera superficie del sesnore, ma è possibile
incrementarla riducendo la dimensione della regione
d'interesse.

Tenendo conto del fattore complessivo di ingrandimento
($75\times 3 = 225$) un'immagine completa corrisponde a una regione
del campione \SI{30x24}{\um}, la dimensione di un singolo pixel
corrisponde invece ad un quadrato di lato \SI{23}{\nm} sul campione.
I valori corretti possono essere determinati solo sperimentalmente
dopo aver fissato l'allineamento del percorso ottico e delle
telecamere.

Per ottenere i fattori reali di conversione tra pixel e dimensioni sul
campione ho sviluppato un programma in ampiente LabVIEW che,
sfruttando una microsfera immobilizzata sul vetrino portaoggetti,
consente di eseguire una calibrazione assistita (sezione
\ref{sec:stabilization}).


\section{Pinzette ottiche}
\label{sec:tweezer}

Il fascio \textit{laser} collimato in uscita da una sorgente
\ce{Nd}:\ce{YVO4}, in alto a destra nello schema di figura
\ref{fig:setup}, dopo essere stato ridotto in diametro
grazie a un telescopio (lenti \texttt{L-TS4a} e \texttt{L-TS4b}),
attraversa immediatamente una serie di due isolatori
ottici, necessari per ridurre al minimo le instabilità della sorgente
dovute alla retro-riflessione, e viene nuovamente ingrandito con un
secondo telescopio (lenti \texttt{L-TS5a} e \texttt{L-TS5b}).
Successivamente, dopo aver attraversato una lamina $\lambda/2$,
viene diviso da un \textit{beam splitter} polarizzatore (\texttt{BS-Twz1})
in due fasci ortogonali.
I due fasci avranno polarizzazioni parallele o perpendicolari rispetto
alla superficie del tavolo ottico, e la lamina $\lambda/2$ consente di
modificare la ripartizione di potenza tra i due rami.
I due rami vengono ricombinati utilizzando un secondo cubo
polarizzatore (\texttt{BS-Twz2}), dopo aver attraversato due
deflettori acusto-ottici
(\textit{Acousto Optic Deflector, AOD}).
Gli AOD vengono realizzati ponendo un cristallo di diossido
di tellurio (\ce{TeO2}) in contatto
con un trasduttore piezoelettrico: la radiofrequenza trasmessa al
trasduttore consente l'instaurazione di un onda stazionaria acustica
all'interno del cristallo, che si comporta sostanzialmente come un
reticolo di diffrazione. Variando l'ampiezza e la frequenza del
segnale
elettrico inviato agli AOD è possibile modificare le caratteristiche
dell'onda acustica stazionaria nel cristallo, e quindi ottenere una
deflessiondel fascio in uscita.

Gli elementi ottici sono allineati in modo che quando a entrambi
gli AOD viene applicato un segnale di \SI{75}{MHz} i due rami
incidano perpendicolarmente sull'ultimo cubo polarizzatore e proseguano
il loro percorso esattamente sovrapposti (linea continua nella
figura \ref{fig:aom}).

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics[width=\linewidth]{images/aom.pdf}
    \caption{Schema per la realizzazione di due pinzette ottiche
        indipendenti.}
    \label{fig:aom}
\end{figure}

Una coppia di lenti piano-convesse incrementa la dimensione del fascio
e rende il
piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il piano
delle uscite degli AOD. In questo modo, per qualsiasi deflessione
angolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappole
passeranno sempre collimati per il centro del piano focale posteriore
dell'obiettivo, con angolo d'incidenza dipendente dalla radiofrequenza
applicata. I fasci, quindi, attraversano l'obiettivo e vengono
focalizzati dentro il campione propagandosi parallelamente all'asse
ottico principale. La variazione di angolo di incidenza nel piano
focale posteriore dell'obiettivo si tradue in uno spostamento
orizzontale dei fasci nel piano del campione: in questo modo,
regolando la radiofrequenza degli AOD è possibile spostare la posizione
delle trappole lungo una linea orizzontale all'interno del campione.

I fattori di conversione tra posizione della trappola nel campione e
frequenza inviata all'AOD, determinati dalle caratteristiche degli AOD
e dalla geometria del sistema ottico, vengono determinati a posteriori
visualizzando microsfere intrappolate e creando rette di calibrazione
(vedi sezione \ref{sec:calibration}).

I deflettori acusto-ottici utilizzati (AA Opto-Electronic, DTSXY-250)
sfruttano onde acustiche di taglio, in cui la velocità di propagazione
dell'onda è perpendicolare al fascio in ingresso; in questo modo i
nodi dell'onda stazionaria si dispongono lungo un asse parallela al
banco ottico.
Questo tipo di deflettori richiedono una polarizzazione in
ingresso lineare e perpendicolare all'onda acustica e producono in uscita un fascio con polarizzazione ortogonale rispetto a quella in ingresso.
Per questo nel
percorso ottico vengono aggiunte due ulteriori lamine $\lambda / 2$:
una permette di aver per entrambi gli AOD la stessa polarizzazione in
ingresso, la seconda ruota nuovamente di \SI{90}{\degree} la
polarizzazione di uno dei due fasci in modo che abbiano polarizzazione
ortogonali prima di ricombinarsi.  L'intervallo di scansione angolare
consentito da questi AOD è di circa \SI{2.8}{\degree}, corrispondenti
a variazioni di \SI{50}{\MHz} nella radiofrequenza fornita. Lungo
questo intervallo l'efficienza dell'AOD, ovvero la frazione di fascio
deflessa nel primo ordine di diffrazione, può variare
significativamente. Questa dipendenza può essere nociva per gli
esperimenti con le pinzette ottiche: se l'intensità dei fasci non è
uniforme per tutte le posizioni della trappola, la costante elastica
della pinzetta ottica varierà durante gli spostamenti, rendendo difficile la manipolazione
del campione attraverso lunghe distanze e potenzialmente falsando i
risultati degli esperimenti.  Variando l'angolo di incidenza del
fascio rispetto all'AOD è possibile ottimizzare questa dipendenza
intorno a un intervallo di deflessioni angolari di nostro
interesse. Resta comunque una variazione non trascurabile della
rigidità delle trappole in funzione della posizione e per tenerne
conto si utilizza un'apposita procedura di calibrazione in cui la
rigidità viene misurata osservando la diffusione di una microsfera
nella trappola, per una griglia equispaziata di punti
(procedura descritta in sezione \ref{sec:calibration}).

Per poter osservare e registrare gli spostamenti delle microsfere
nella trappole così realizzate è stato implementato un sistema
di rilevamento della radiazione nel piano focale posteriore del
condensatore
(\textit{back-focal plane detection}, BFPD).

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics[width=\linewidth]{images/bfp.pdf}
    \caption{Principio di funzionamento della \textit{back-focal-plane detection} e andamento della sensibilità al variare della
    dimensione dello \textit{spot}}
    \label{fig:bfp}
\end{figure}

Il profilo d'intensità della luce diffusa in avanti da una microsfera
in una trappola ottica, rilevato nel piano focale posteriore, permette
di conoscere la posizione relativa della microsfera rispetto al centro
della trappola, senza dipendere (in condizioni ideali) dalla posizione
assoluta della trappola nel campione.

Per sfruttare questa proprietà la radiazione a \SI{1064}{\nm} è
estratta dal cammino ottico successivo al condensatore grazie ad uno
specchio dicroico. Successivamente le due polarizzazioni,
corrispondenti alle due trappole, vengono separate da un cubo
polarizzatore, e inviate rispettivamente a due fotodiodi a quadranti
(\textit{Quadrant Photodiode Detector, QPD}), posizionati in un piano
coniugato con il piano focale posteriore del condensatore.
In questo piano la distribuzione spaziale del campo elettrico è data
dalla trasformata di Fourier del campo in corrispondenza del piano
del campione messo a fuoco. È possibile dimostrare che nel caso di
una sfera spostata rispetto al centro della trappola l'asimmetria del
profilo d'intensità nel piano focale posteriore sarà direttamente
proporzionale allo spostamento della sfera rispetto al centro
della trappola. Grazie ai due QPD possiamo quindi quantificare
l'asimmetria del profilo d'intensità della radiazione diffusa
in avanti lungo due assi ortogonali, ottenendo letture proporzionali
agli spostamenti relativi della microsfera. Queste letture vengono
prodotte da un sistema di amplificatori differenziali che opera
sui quattro quadranti, producendo in uscita segnali la cui tensione,
dopo opportuna calibrazione, può essere messa in relazione allo
spostamento della microsfera.

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics[width=\textwidth]{images/qpd.pdf}
    \caption{Schema per la rilevazione della posizione relativa
    della microsfera.}
    \label{fig:qpd}
\end{figure}

Maggiori dettagli sull'elettronica che consente il controllo
della deflessione attraverso gli AOD e la lettura del segnale
dei QPD sono forniti nell'appendice \ref{app:electronics}, mentre
le procedure di calibrazione sono trattate nella sezione
\ref{sec:calibration}.

\section{Fluorescenza}

Il percorso di eccitazione per la microscopia di fluorescenza
è realizzato a partire da tre sorgenti \textit{laser}:

\begin{itemize}
    \item \textbf{\SI[detect-weight = true]{488}{\nm}:}
        Cobolt MLD™ 488, con potenza regolabile tra
        \SIlist{0;60}{\mW} attraverso programma di controllo.
    \item \textbf{\SI[detect-weight = true]{532}{\nm}:}
        Coherent Sapphire, con potenza regolabile tra
        \SIlist{0;200}{\mW} attraverso manopola di controllo.
    \item \textbf{\SI[detect-weight = true]{635}{\nm}:}
        Blue Sky Research FTEC-2-635, con potenza regolabile tra
        \SIlist{0;60}{mW} attraverso modulazione analogica in
        tensione.

\end{itemize}

Le tre sorgenti si trovano fuori dal tavolo ottico e la radiazione
viene trasportata attraverso tre fibre ottiche.
Sul tavolo ottico la radiazione viene emessa nello spazio libero
tramite tre collimatori con specifiche diverse.

\begin{table}[ht]
    \centering
    \begin{tabular}{c c c c}
        \toprule
         $\lambda [\si{\nm}]$ & f [\si{\mm}] & $(\textrm{BD})_{1/e^2} ~[\si{\mm}]$ & M\\
         \midrule
         488 & 4 & 0.49 & 3.33x\\
         532 & 11 & 1.57 &\\
         635 & 6 & 1.07 & 1.66x\\
         \bottomrule
    \end{tabular}
    \caption{Collimatori usati per estrarre i fasci alle varie
    lunghezzed d'onda, con distanza focale indicata dal costruttore
    (f) e diametro del fascio (BD) misurato mediante \textit{fit}
    gaussiano del suo profilo d'intensità. Nella colonna
    M è riportato il fattore d'ingrandimento che abbiamo selezionato
    per ottenere fasci con dimensioni consistenti, attraverso l'utilizzo
    di telescopi.}
    \label{tab:my_label}
\end{table}

I fasci a \SIlist{488;635}{\nm} vengono ingranditi mediante due
telescopi realizzati con lenti piano-convesse, in questo modo si
ottengono dimensioni del fascio, e quindi caratteristiche di
uniformità nell'illuminazione del campione, confrontabili e simili per
tutte le lunghezze d'onda usate.  Per il fascio a 635 nm si ottiene un
fattore d’ingrandimento di 1.66x utilizzando le lenti \texttt{L-TS1a}
e \texttt{L-TS1b}, per quello a \SI{488}{\nm} un fattore
d’ingrandimento 3.33x utilizzando le lenti \texttt{L-TS2a} e
\texttt{L-TS2b}.  L'emissione dei laser a diodo deve essere filtrata
attraverso filtri passa-banda stretti per evitare che radiazione a
lunghezze d'onda spurie diffonda nel campione e contamini l'emissione
di fluorescenza.

I tre fasci laser vengono combinati in un unico percorso ottico
attraverso due specchi dicroici (uno ottimizzato per riflettere il
90\% della radiazione a lunghezze d'onda inferiori ai 532 nm,
\texttt{DIC-532}, e l'altro per riflettere il 90\% di quelle inferiori
a 488 nm, \texttt{DIC-488}).  Successivamente il fascio con le tre
lunghezze d'onda combinate viene ingrandito di un fattore 10x per
mezzo di un ulteriore telescopio sul percorso comune, formato dalle
lenti \texttt{L-TS3a} e \texttt{L-TS3b}, raggiungendo un diametro
$\approx \SI{2}{\cm}$.

I fasci combinati sono focalizzati sul piano focale posteriore
dell'obiettivo da una lente con focale $f = \SI{500}{\mm}$, ottenendo,
in combinazione con uno dei due obiettivi di focale \SI{3.3}{\mm},
un fattore di scala di circa $1/150$ e quindi un diametro
$(\textrm{BD})_{1/e^2}$ sul campione di circa \SI{130}{\um}.
Per immettere i fasci di eccitazione nel cammino ottico che porta
all'obiettivo si usa un dicroico di fluorescenza a tre bande,
in grado di riflettere le tre lunghezze d'onda di eccitazione e
trasmettere tre finestre di emissione nel quale ricadono i fluorofori
più comunemenete eccitati a tali lunghezze d'onda.
La fluorescenza riemessa all'indietro dal campione, e quindi trasmessa
dal dicroico di fluorescenza, è combinata con l'illuminazione a luce
trasmessa, da cui sarà disaccoppiata per mezzo di un successivo
dicroico.

Il percorso di raccolta dell'emissione di fluorescenza, infatti,
condivide la stesse ottiche di ingrandimento con il percorso di
raccolta della luce trasmessa e quindi lo stesso fattore di 
ingrandimento $\approx 225x$.

Uno specchio dicroico passa-alto con frequenza di taglio di \SI{705}{\nm}
viene utilizzato per estrarre l'emissione di fluorescenza dal
cammino di raccolta e indirizzarla verso il sensore di una fotocamera
di tipo \textit{Electron-Multiplying Charged Coupled Device (EmCCD)}.

La regione attiva del sensore è di \SI{8.19x8.19}{\mm},
corrispondente ad un quadrato di lato \SI{36}{\um} sul piano del campione.
Il diametro
del fascio di eccitazione, \SI{130}{\um},
è significativamente maggiore di questo
valore per massimizzare l'uniformità della potenza con la quale
la regione di interesse viene illuminata.
Dai calcoli eseguiti in seizone \ref{sec:single_molecule_fluorescence},
per questi parametri risulta una variazione massima di intensità del
17\% all'interno della regione.

La camera usata per la rilevazione della fluorescenza è una ImagEM X2
C9100-23B (Hamamatsu).
Questo tipo di telecamera combina, al funzionamento tipico dei
Charged-Coupled-Device (CCD), uno stadio di moltiplicazione degli
elettroni, che consente di raggiungere, in presenza di raffreddamento
a temperature inferiori ai -60°C, la sensibilità del singolo
fotone. Maggiori dettagli sulla messa in opera del sistema di imaging
sono forniti in sezione \ref{sec:single_molecule_fluorescence}.

Per poter realizzare gli schemi di illuminazione HILO e TIRF è stato
introdotto, nella parte terminale del percorso di eccitazione, prima
del filtro dicroico, uno specchio mobile controllato elettronicamente.
Azionando questo specchio è possibile ottenere uno spostamento
orizzontale del fascio di eccitazione, e quindi, poiché esso
attraverserà il piano focale posteriore dell'obiettivo in un punto
diverso dal suo centro, si avrà una deflessione angolare del fascio di
eccitazione in uscita dall'obiettivo.








\begin{sidewaysfigure}
    \includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/setup.pdf}
    \caption{Vista d'insieme dell'apparato sperimentale}
    \label{fig:setup}
\end{sidewaysfigure}

\begin{sidewaystable}
    \centering
    \begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l}
    \toprule
         Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\
    \midrule
    \multicolumn{5}{l}{\it Percorso eccitazione fluorescenza}\\
        F-Clean635
            & Filtro passa-banda
            & Pulizia spettrale laser \SI{635}{\nm}
            & $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm},
              bw: \SI{14}{\nm}$
            & FF01-640/14-25\\
        L-TS1a
            & Lente sferica piano-convessa
            & Telescopio per laser a \SI{635}{\nm}
            & f: \SI{30}{\mm}
            & \\
        L-TS1b
            & &
            & f: \SI{50}{\mm}
            & \\
        L-TS2a
            &
            & Telescopio per laser a \SI{488}{\nm}
            & f: \SI{30}{\mm}
            & \\
        L-TS2b
            & &
            & f: \SI{100}{\mm}
            & \\
        DIC-532
            & Filtro dicroico single-edge
            & Inserimento fascio a 532nm
            & $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$
            & Di02-R532-25-D\\
        DIC-488
            & & Inserimento fascio a 488nm
            & $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$
            & Di02-R488-25-D\\
        L-TS3a
            & Doppietto acromatico
            & Ingrandimento fasci fluorescenza
            & f: \SI{19}{\mm}
            & \\
        L-TS3b
            & & 
            & f: \SI{200}{\mm}
            & \\
        L-Exc
            &
            & Focalizzazione fascio fluorescenza
            & f: \SI{500}{\mm} 
            & \\
        DIC-Fluor
            & Filtro dicroico quad-edge
            & Separazione eccitazione/emissione
            & $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$
            & Di03-R405/488/532/635-t1 \\
    \multicolumn{5}{l}{\it Percorso trappole}\\
        L-TS4a
            & Lente sferica piano-convessa
            & Inserimento laser 1064nm in isolatore.
            & %f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-TS4b
            & & 
            & %f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-TS5a
            & Lente sferica piano-convessa
            & Ingrandimento fascio 1064nm
            & %f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-TS5b
            & & 
            & %f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-Twz1
            & Lente sferica piano-convessa
            & Ingrandimento rappole dopo AOD
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-Twz2  
            & & 
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        DIC-Twz1
            & Lente sferica piano-convessa
            & Inserimento fascio trappole
            & $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$
            & \\
    \multicolumn{5}{l}{\it Percorso Imaging}\\
        L-Im1  
            & Tube Lens
            & Tube Lens
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-Im2  
            & Imaging Lens
            & Imaging Lens
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        DIC-BF
            & Filtro dicroico single-edge
            & Seprazione fluorescenza/brightfied
            & $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$
            & FF705-Di01-25x36\\
        F-BlockBF
            & Filtro passa-basso
            & Soppressione brightfield residuo
            & $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$
            & FESH0700\\
        F-Emiss
            & Filtro passa-banda quad-band
            & Fluorofori/Soppressione laser eccitazione
            & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$
            & FF01-446/510/581/703\\
        F-BlockTwz
            & Filtro band-stop
            & Soppressione laser trappole residuo
            & $\lambda_{centr}: 1064nm$
            & \\
     \end{tabular}
     \caption{Lista delle componenti ottiche}
     \label{tab:optical_components}
 \end{sidewaystable}
 
