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@ -511,4 +511,52 @@ suo spostamento dalla posizione di riposo. |
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\section{Microscopia di fluorescenza di singola molecola} |
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Le microscopia di fluorescenza |
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Tipicamente, le tecniche di microscopia di fluorescenza di singola |
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molecola consentono di sondare la posizione e i movimenti di singole |
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molecole con risoluzioni spaziali e temporali prossime, |
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rispettivamente, al nanometro e al millisecondo. |
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In ambito biologico le molecole che vengono osservate con questa |
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tecniche sono polimeri di varia natura, come proteine e acidi |
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nucleici. Anche se alcune di queste molecole possono avere una |
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debole fluorescenza intrinseca, si fa quasi sempre ricorso alla |
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marcatura con fluorofori, cioè molecole con caratteristiche di |
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fluorescenza note e elevata resa quantica. In questo modo è |
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possibile ottenere livelli di segnale maggiori e soprattutto |
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una elevata specificità nel rendere rilevabili solo le molecole |
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che presentano caratteristiche di interesse. |
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Queste due proprietà sono, come vedremo, molto importanti per |
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raggiungere un'elevata precisione di localizzazione. |
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Le tecniche di microscopia di fluorescenza sono molto flessibili |
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e spesso non distruttive: consentono di osservare processi biologici |
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in tempo reale in celle di reazione, colture cellulari e organismi |
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viventi. |
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Un esperimento di microscopia di fluorescenza generalmente |
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comprende due fasi principali: |
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\begin{itemize} |
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\item La marcatura delle molecole di interesse, ovvero |
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l'attuazione di un protocollo per legare specificamente il |
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fluoroforo scelto alle molecole che si intende visualizzare. |
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\item La produzione delle immagini, mediante l'illuminazione del |
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campione alla lunghezza d'onda di eccitazione del fluoroforo |
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e la raccolta della radiazione emessa alla lunghezza d'onda |
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di emissione. |
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\end{itemize} |
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Per quanto riguarda la marcatura (o \textit{labeling}) delle |
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molecole esistono svariate strategie e tipologie di fluorofori |
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utilizzabili. Il fluoroforo può essere legato covalentemente alla |
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molecola di interesse attraverso apposite reazioni chimiche, |
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può essere incorporato in un anticorpo, ovvero una proteina |
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in grado di riconoscere siti specifici di altre molecole e legarvisi |
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non covalentemente, oppure tramite l'ingegneria genetica è possibile |
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fornire a delle cellule le istruzioni per sintetizzare e assemblare |
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proteine contenenti regioni fluorescenti. |
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I fluorofori utilizzati possono essere piccole molecole organiche, |
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nanoparticelle realizzate in materiali semiconduttori (come i punti |
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quantici) oppure sequenze di amminoacidi. |
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Per la produzione delle immagini esistono due macrocategorie di |
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tecniche: |