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@ -511,4 +511,52 @@ suo spostamento dalla posizione di riposo.
\section{Microscopia di fluorescenza di singola molecola} \section{Microscopia di fluorescenza di singola molecola}
Le microscopia di fluorescenza
Tipicamente, le tecniche di microscopia di fluorescenza di singola
molecola consentono di sondare la posizione e i movimenti di singole
molecole con risoluzioni spaziali e temporali prossime,
rispettivamente, al nanometro e al millisecondo.
In ambito biologico le molecole che vengono osservate con questa
tecniche sono polimeri di varia natura, come proteine e acidi
nucleici. Anche se alcune di queste molecole possono avere una
debole fluorescenza intrinseca, si fa quasi sempre ricorso alla
marcatura con fluorofori, cioè molecole con caratteristiche di
fluorescenza note e elevata resa quantica. In questo modo è
possibile ottenere livelli di segnale maggiori e soprattutto
una elevata specificità nel rendere rilevabili solo le molecole
che presentano caratteristiche di interesse.
Queste due proprietà sono, come vedremo, molto importanti per
raggiungere un'elevata precisione di localizzazione.
Le tecniche di microscopia di fluorescenza sono molto flessibili
e spesso non distruttive: consentono di osservare processi biologici
in tempo reale in celle di reazione, colture cellulari e organismi
viventi.
Un esperimento di microscopia di fluorescenza generalmente
comprende due fasi principali:
\begin{itemize}
\item La marcatura delle molecole di interesse, ovvero
l'attuazione di un protocollo per legare specificamente il
fluoroforo scelto alle molecole che si intende visualizzare.
\item La produzione delle immagini, mediante l'illuminazione del
campione alla lunghezza d'onda di eccitazione del fluoroforo
e la raccolta della radiazione emessa alla lunghezza d'onda
di emissione.
\end{itemize}
Per quanto riguarda la marcatura (o \textit{labeling}) delle
molecole esistono svariate strategie e tipologie di fluorofori
utilizzabili. Il fluoroforo può essere legato covalentemente alla
molecola di interesse attraverso apposite reazioni chimiche,
può essere incorporato in un anticorpo, ovvero una proteina
in grado di riconoscere siti specifici di altre molecole e legarvisi
non covalentemente, oppure tramite l'ingegneria genetica è possibile
fornire a delle cellule le istruzioni per sintetizzare e assemblare
proteine contenenti regioni fluorescenti.
I fluorofori utilizzati possono essere piccole molecole organiche,
nanoparticelle realizzate in materiali semiconduttori (come i punti
quantici) oppure sequenze di amminoacidi.
Per la produzione delle immagini esistono due macrocategorie di
tecniche:

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