@ -420,22 +420,22 @@ come mostrato in figura \ref{fig:trap_ccurves}.
Un esperimento di \textit { force-clamp} consiste nello studiare la
dinamica della formazione e della rottura del legame tra due
molecole quando queste sono sottoposte a una determinata
molecole quando queste sono sottoposte a una determinata
forza di trazione costante.
Per poter applicare una tale forza tramite una microsfera catturata
in una pinzetta ottica è stato implementato un sistema di retroazione
tra la lettura della posizione relativa della microsfera nella
trappola (dai QPD) e la posizione della trappola nel campione (tramite
gli AOM ).
gli AOD ).
Scelto un valore per la forza (F) si può ricavare, conoscendo il
valore di $ k $ , il corrispondente spostamento $ \Delta x $ rispetto al
centro della trappola.
Per ottenere un valore forza applicata $ F $ è necessario porsi
nella condizione in cui la microsfera si è spostata di $ - k / F $ dalla
posizione di equilibrio.
posizione di equilibrio.
Se definiamo questa posizione come $ x _ { SET } $ e avviamo un ciclo di
retroazione in cui
comandandiamo agli AOM uno spostamento della trappola proporzionale
comandandiamo agli AOD uno spostamento della trappola proporzionale
alla differenza tra la posizione, rilevata dai QPD, della microsfera e
$ x _ { SET } $ , possono verificarsi i due seguenti casi:
@ -474,21 +474,25 @@ legame analizzato.
Per realizzare sperimentalmente questa misura occorre un sistema
elettronico in grado di campionare il segnale prodotto dai QPD e
modificare di conseguenza la frequenza del segnale di modulazione invato
agli AOM.
Per garantire un funzionamento stabile e la possibilità
di rilevare eventi di durata confrontabile con il tempo di rilassamento
diffusivo si utilizza una scheda elettronica programmabile dedicata,
di tipo FPGA (\textit { Field Programmable Gate Array} ), per controllare
il ciclo di retroazione.
In questo modo è possibile leggere i valori di posizione e aggiustare
il segnale generato per gli AOM a una frequenza di \SI { 200} { \kHz } , pari
al doppio della larghezza di banda dei diodi usati nei QPD.
La scheda FPGA (National Instruments) è stata programmata con un codice
progettato in ambiente LabVIEW, e comunica con un apposito programma
in esecuzione sul PC di controllo dell'esperimento per configurare i
parametri sperimentali e memorizzare i tracciati (\texttt { Force-Clamp Control} ).
modificare di conseguenza la frequenza del segnale di modulazione
invato agli AOD. Per garantire un funzionamento stabile e la
possibilità di rilevare eventi di durata confrontabile con il tempo di
rilassamento diffusivo si utilizza una scheda elettronica
programmabile dedicata, di tipo FPGA (\textit { Field Programmable Gate
Array} ), per controllare il ciclo di retroazione. In questo modo è
possibile leggere i valori di posizione e aggiustare il segnale
generato per gli AOD a una frequenza di \SI { 200} { \kHz } , pari al doppio
della larghezza di banda dei diodi usati nei QPD.
Per permettere alla scheda FPGA (National Instruments) di dialogare
con gli AOD e i QPD, così come per poter registrare sul computer i
tracciati della posizione delle trappole, ho progettato i circuiti
logici di funzionamento della scheda grazie all'ambiente di sviluppo
LabVIEW FPGA (maggiori dettagli in appendice \ref { app:electronics} ).
La scheda FPGA così programmata comunica con il PC di controllo
dell'esperimento dove è in esecuzione un apposito programma LabVIEW,
sviluppato per consentire all'utente di modificare i parametri di
funzionamento dell'esperimento e registrare le tracce temporali.
In figura \ref { fig:forceclamp-feedback} è mostrato uno schema
semplificato del ciclo di retroazione implementato per ciascuna
@ -548,23 +552,52 @@ applicata sul legame è pari a quella selezionata.}
\end { figure}
In figura \ref { fig:three_ beads} è rappresentato lo schema realizzato.
In mancanza di legame, il sistema continuerebbe a muovere le trappole
indefinitamente fino a raggiungere regioni dove l'efficienza
di intrappolamento non è più sufficiente oppure a esaurire l'intervallo
di deflessioni ottenibili con gli AOM.
Per evitare questo si decide di limitare gli spostamenti massimi
delle trappole in un intervallo di qualche \si { nm} , implementando
un sistema di ``riflessione'': quando il fascio che sta tentando di
applicare la forza selezionata $ \Delta F $ si è spostato di un determinato
cammino massimo, si scambia il ruolo delle due trappole e si applica
un incremento di forza $ - \Delta F $ sulla trappola che prima
era passiva. In questo modo la tensione applicata sul sistema meccanico
è uguale in modulo e opposta in verso. Inoltre il sistema può continuare
ad acquisire dati autonomamente per lunghi intervalli di tempo senza
la necessità di interventi manuali.
Un doppio sistema di feedback, per ciascuna delle due trappole, muove
i fasci di intrappolamento in modo da inseguire una posizione target
per ciascuna microsfera. La forza viene applicata impostando, per la
posizione target di una delle due microsfere, uno scostamento ($ \delta
x$ ) rispetto alla posizione di equilibrio tra costante elastica della
trappola e tensione del filamento ($ \Delta x $ ). Fino a che non viene
stabilito un legame con una molecola immobilizzata sulla sfera
piedistallo, il sistema continua a muovere in una direzione e
simultaneamente le due trappole (verso destra nell’esempio mostrato in
figura): la trappola di destra si muove, per compensare lo scostamento
tra microsfera e posizione target, verso destra, e, immediatamente, la
trappola di sinistra la segue per compensare l’eccesso di tensione sul
filamento. Quando un legame viene finalmente stabilito con la proteina
immobilizzata, sarà possibile per mantenere il sistema in equilibrio
con le due microsfere nelle posizioni target: in queste condizione,
sul legame tra le due proteine, viene applicata una forza
proporzionale a $ \delta x $ secondo la costante elastica della trappola. Per
evitare che, quando non vi è alcun legame con proteine immobilizzate,
le due trappole si spostino troppo rispetto alla loro posizione
ottimale di funzionamento, si decide di limitare gli spostamenti
massimi di esse in un intervallo di qualche \si { nm} , implementando un
sistema di ``riflessione'': quando il fascio che sta tentando di
applicare la forza selezionata $ \Delta F $ si è spostato di un
determinato cammino massimo, si scambia il ruolo delle due trappole e
si applica un incremento di forza $ - \Delta F $ sulla trappola che prima
era passiva. In questo modo la tensione applicata sul sistema
meccanico è uguale in modulo e opposta in verso. Inoltre il sistema
può continuare ad acquisire dati autonomamente per lunghi intervalli
di tempo senza la necessità di interventi manuali. In figura
\ref { fig:timeser} è mostrato un esempio di tracce temporali per
l'andamento della forza e della posizione trappole che è possibile
ottenere per un esperimento di questo tipo. Si osservi l'andamento
oscillatorio periodico della posizione, corrispondente allo stato
``non legato'' e l'improvvisa interruzione degli spostamenti in
corrispondenza della formazione del legame.
\begin { figure}
\centering \includegraphics [width=0.7\linewidth] { fc_ timetrace.pdf}
\caption { Esempio di andamento temporale dei valori acquisiti di
forza e posizione per un esperimento di spettroscopia force-clamp
\cite { Capitanio2012} .}
\label { fig:timeser}
\end { figure}
Uno schema di questo tipo è già stato utilizzato per lo studio
dell'interazione di motori molecolari (come la \textit { miosina} ) e
dell'interazione di motori molecolari (come la \textit { miosina} ) e
filamenti di \textit { actina} .
Nello studio delle giunzioni cellulari sono ipotizzabili numerosi
esperimenti in cui uno o più fattori appartenenti ai complessi
@ -594,26 +627,35 @@ finestre riportate in tabella \ref{tab:fluo_lambda}:
$ \lambda $ eccitazione [\si { nm} ] & $ \lambda $ emissione [\si { nm} ] & Potenza massima [\si { mW} ] \\
\midrule
\num { 488} & \numrange { 502.5} { 518.5} & \num { 1.6} \\
\num { 532} & \numrange { 550.0} { 613.0} & \num { 1.1 } \\
\num { 532} & \numrange { 550.0} { 613.0} & \num { 5.5 } \\
\num { 635} & \numrange { 663.0} { 700.0} & \num { 2.4} \\
\bottomrule
\end { tabular}
\caption { Lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione compatibili con l'apparato sperimentale, e potenza
elettromagnetica totale immessa nel campo visivo.}
\caption { Lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione compatibili
con l'apparato sperimentale, e potenza elettromagnetica totale
immessa nel campo visivo. I valori di potenza massima riportata
sono la potenza ottica misurata, attraverso un \textit { power
meter} , all'uscita dell'obiettivo, quando le sorgenti laser
sono impostate per erogare la massima potenza.}
\label { tab:fluo_ lambda}
\end { table}
Per ciascuna lunghezza d'onda è possibile ottenere una potenza totale nel campo
visivo raccolto dal sensore EMCCD $ \SI { 1 } { mW } $ .
Per confrontare le proprietà di fluorofori a diverse lunghezze d'onda scegliamo
di impostare l'emissione di tutte le sorgenti laser in modo da avere sempre
$ \SI { 1 } { \mW } $ di potenza ottica sul campione.
Per rendere uniforme la distribuzione di potenza nel campo visivo si tronca il
fascio gaussiano prima di focalizzarlo sull'obiettivo a un raggio pari circa
a 1/15 di quello iniziale (corrispondente alle dimensione del
campo visivo sul campione).
In questo modo le deviazione massima d'intensità tra i bordi e il centro
della regione illuminata è ridotta al \SI { 17} { \percent } (figura \ref { fig:flatfield} ).
Per ciascuna lunghezza d'onda è possibile ottenere una potenza totale
nel campo visivo raccolto dal sensore EMCCD $ \SI { 1 } { mW } $ . Per
confrontare le proprietà di fluorofori a diverse lunghezze d'onda
scegliamo di impostare l'emissione di tutte le sorgenti laser in modo
da avere sempre $ \SI { 1 } { \mW } $ di potenza ottica sul campione. Per
rendere uniforme la distribuzione di potenza nel campo visivo si
tronca il fascio gaussiano prima di focalizzarlo sull'obiettivo a un
raggio pari circa a 1/4 di quello iniziale (corrispondente alle
dimensione del campo visivo sul campione). Infatti, il diametro
misurato prima di focalizzare il fascio sull'obiettivo, di circa
\SI { 2} { \cm } , corrisponde a uno spot sul campione di diametro
\SI { 130} { \um } , circa quattro volte quello dell'area sul campione
corrispondente alla superficie del sensore della telecamera. In
questo modo le deviazione massima d'intensità tra i bordi e il centro
della regione illuminata è ridotta al \SI { 17} { \percent } (figura
\ref { fig:flatfield} ).
\begin { figure} [ht]
\centering
@ -761,11 +803,27 @@ laser usato per la fluorescenza, potrebbe diventare significativo l'effetto dell
di radiazione del fascio obliquo sulle microsfere intrappolate, variando la dinamica delle
loro fluttuazioni e quindi influenzando la corretta esecuzione del \textit { force-clamp} .
Tuttavia, lo schema HILO ha il grande vantaggio di non richiedere una
tunabilità fine del laser di eccitazione necessaria per eccitare i
modi risonanti della microsfera. Abbiamo infatti testato questa
modalità acquisendo immagini di singoli fluorofori, legati alla
superficie di microsfere immobilizzate sulla superficie di un vetrino
coprioggetti e confrontando le immagini ottenute in schema HILO per
diverse posizioni del piano focale. Il risultato di questo confronto è
mostrato in figura \ref { fig:bfvshilo} . I singoli fluorofori
visualizzati nella terza immagine sono quelli che si trovano sulla
sommità delle microsfere e vengono eccitati dal fascio inclinato
(HILO), a una distanza di \SI { 1.4} { \um } dal piano selezionato
nell'immagine precedente (b). La regione mostrata, di grandezza
\SI { 40} { \um } x \SI { 40} { \um } è stata ottenuta con una potenza ottica
sul campione di 1mW e un tempo di integrazione di 30ms. Per acquisire
regioni di interesse molto più piccole, come quella nell’immediata
prossimità di due proteine interagenti in un esperimento di
force-clamp, è ragionevole prevedere la possibilità di raggiungere la
sensibilità di singolo fluoroforo con tempi di integrazione
dell’ordine del millisecondo.
\begin { figure} [h]
\begin { figure} [ht]
\centering
\begin { subfigure} { 0.45\linewidth }
\centering
@ -785,3 +843,10 @@ loro fluttuazioni e quindi influenzando la corretta esecuzione del \textit{force
TIRF (a) e HILO (b).}
\label { fig:three_ beads}
\end { figure}
\begin { figure} [ht]
\centering
\includegraphics [width=0.8\linewidth] { wfvshilo.png}
\caption { Fluoroforo Alexa Fluor 647 su microsfere di silice, immobilizzate. Immagini in bright-field (a), HILO al livello della superficie interna del campione (b) e HILO a \SI { 1.4} { \um } di profondità (c).}
\label { fig:bfvshilo}
\end { figure}
Lorenzo Zolfanelli
4 years ago
