capitans correzioni cap 3 bis

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@@ -420,22 +420,22 @@ come mostrato in figura \ref{fig:trap_ccurves}.
 
 Un esperimento di \textit{force-clamp} consiste nello studiare la
 dinamica della formazione e della rottura del legame tra due
-molecole quando queste sono sottoposte a una determinata 
+molecole quando queste sono sottoposte a una determinata
 forza di trazione costante.
 Per poter applicare una tale forza tramite una microsfera catturata
 in una pinzetta ottica è stato implementato un sistema di retroazione
 tra la lettura della posizione relativa della microsfera nella
 trappola (dai QPD) e la posizione della trappola nel campione (tramite
-gli AOM).
+gli AOD).
 Scelto un valore per la forza (F) si può ricavare, conoscendo il
 valore di $k$, il corrispondente spostamento $\Delta x$ rispetto al
 centro della trappola.
 Per ottenere un valore forza applicata $F$ è necessario porsi
 nella condizione in cui la microsfera si è spostata di $-k/F$ dalla
-posizione di equilibrio. 
+posizione di equilibrio.
 Se definiamo questa posizione come $x_{SET}$ e avviamo un ciclo di
 retroazione in cui
-comandandiamo agli AOM uno spostamento della trappola proporzionale
+comandandiamo agli AOD uno spostamento della trappola proporzionale
 alla differenza tra la posizione, rilevata dai QPD, della microsfera e
 $x_{SET}$, possono verificarsi i due seguenti casi:
 
@@ -474,21 +474,25 @@ legame analizzato.
 
 Per realizzare sperimentalmente questa misura occorre un sistema
 elettronico in grado di campionare il segnale prodotto dai QPD e
-modificare di conseguenza la frequenza del segnale di modulazione invato
-agli AOM.
-Per garantire un funzionamento stabile e la possibilità
-di rilevare eventi di durata confrontabile con il tempo di rilassamento
-diffusivo si utilizza una scheda elettronica programmabile dedicata,
-di tipo FPGA (\textit{Field Programmable Gate Array}), per controllare
-il ciclo di retroazione.
-In questo modo è possibile leggere i valori di posizione e aggiustare
-il segnale generato per gli AOM a una frequenza di \SI{200}{\kHz}, pari
-al doppio della larghezza di banda dei diodi usati nei QPD.
-
-La scheda FPGA (National Instruments) è stata programmata con un codice
-progettato in ambiente LabVIEW, e comunica con un apposito programma
-in esecuzione sul PC di controllo dell'esperimento per configurare i
-parametri sperimentali e memorizzare i tracciati (\texttt{Force-Clamp Control}).
+modificare di conseguenza la frequenza del segnale di modulazione
+invato agli AOD.  Per garantire un funzionamento stabile e la
+possibilità di rilevare eventi di durata confrontabile con il tempo di
+rilassamento diffusivo si utilizza una scheda elettronica
+programmabile dedicata, di tipo FPGA (\textit{Field Programmable Gate
+  Array}), per controllare il ciclo di retroazione.  In questo modo è
+possibile leggere i valori di posizione e aggiustare il segnale
+generato per gli AOD a una frequenza di \SI{200}{\kHz}, pari al doppio
+della larghezza di banda dei diodi usati nei QPD.
+
+Per permettere alla scheda FPGA (National Instruments) di dialogare
+con gli AOD e i QPD, così come per poter registrare sul computer i
+tracciati della posizione delle trappole, ho progettato i circuiti
+logici di funzionamento della scheda grazie all'ambiente di sviluppo
+LabVIEW FPGA (maggiori dettagli in appendice \ref{app:electronics}).
+La scheda FPGA così programmata comunica con il PC di controllo
+dell'esperimento dove è in esecuzione un apposito programma LabVIEW,
+sviluppato per consentire all'utente di modificare i parametri di
+funzionamento dell'esperimento e registrare le tracce temporali.
 
 In figura \ref{fig:forceclamp-feedback} è mostrato uno schema
 semplificato del ciclo di retroazione implementato per ciascuna
@@ -548,23 +552,52 @@ applicata sul legame è pari a quella selezionata.}
 \end{figure}
 
 In figura \ref{fig:three_beads} è rappresentato lo schema realizzato.
-In mancanza di legame, il sistema continuerebbe a muovere le trappole
-indefinitamente fino a raggiungere regioni dove l'efficienza
-di intrappolamento non è più sufficiente oppure a esaurire l'intervallo
-di deflessioni ottenibili con gli AOM.
-Per evitare questo si decide di limitare gli spostamenti massimi
-delle trappole in un intervallo di qualche \si{nm}, implementando
-un sistema di ``riflessione'': quando il fascio che sta tentando di
-applicare la forza selezionata $\Delta F$ si è spostato di un determinato
-cammino massimo, si scambia il ruolo delle due trappole e si applica
-un incremento di forza $-\Delta F$ sulla trappola che prima
-era passiva. In questo modo la tensione applicata sul sistema meccanico
-è uguale in modulo e opposta in verso. Inoltre il sistema può continuare
-ad acquisire dati autonomamente per lunghi intervalli di tempo senza
-la necessità di interventi manuali.
+Un doppio sistema di feedback, per ciascuna delle due trappole, muove
+i fasci di intrappolamento in modo da inseguire una posizione target
+per ciascuna microsfera. La forza viene applicata impostando, per la
+posizione target di una delle due microsfere, uno scostamento ($\delta
+x$) rispetto alla posizione di equilibrio tra costante elastica della
+trappola e tensione del filamento ($\Delta x$). Fino a che non viene
+stabilito un legame con una molecola immobilizzata sulla sfera
+piedistallo, il sistema continua a muovere in una direzione e
+simultaneamente le due trappole (verso destra nell’esempio mostrato in
+figura): la trappola di destra si muove, per compensare lo scostamento
+tra microsfera e posizione target, verso destra, e, immediatamente, la
+trappola di sinistra la segue per compensare l’eccesso di tensione sul
+filamento. Quando un legame viene finalmente stabilito con la proteina
+immobilizzata, sarà possibile per mantenere il sistema in equilibrio
+con le due microsfere nelle posizioni target: in queste condizione,
+sul legame tra le due proteine, viene applicata una forza
+proporzionale a $\delta x$ secondo la costante elastica della trappola.  Per
+evitare che, quando non vi è alcun legame con proteine immobilizzate,
+le due trappole si spostino troppo rispetto alla loro posizione
+ottimale di funzionamento, si decide di limitare gli spostamenti
+massimi di esse in un intervallo di qualche \si{nm}, implementando un
+sistema di ``riflessione'': quando il fascio che sta tentando di
+applicare la forza selezionata $\Delta F$ si è spostato di un
+determinato cammino massimo, si scambia il ruolo delle due trappole e
+si applica un incremento di forza $-\Delta F$ sulla trappola che prima
+era passiva. In questo modo la tensione applicata sul sistema
+meccanico è uguale in modulo e opposta in verso. Inoltre il sistema
+può continuare ad acquisire dati autonomamente per lunghi intervalli
+di tempo senza la necessità di interventi manuali.  In figura
+\ref{fig:timeser} è mostrato un esempio di tracce temporali per
+l'andamento della forza e della posizione trappole che è possibile
+ottenere per un esperimento di questo tipo. Si osservi l'andamento
+oscillatorio periodico della posizione, corrispondente allo stato
+``non legato'' e l'improvvisa interruzione degli spostamenti in
+corrispondenza della formazione del legame.
+
+\begin{figure}
+  \centering \includegraphics[width=0.7\linewidth]{fc_timetrace.pdf}
+  \caption{Esempio di andamento temporale dei valori acquisiti di
+    forza e posizione per un esperimento di spettroscopia force-clamp
+    \cite{Capitanio2012}.}
+  \label{fig:timeser}
+\end{figure}
 
 Uno schema di questo tipo è già stato utilizzato per lo studio
-dell'interazione di motori molecolari (come la \textit{miosina}) e 
+dell'interazione di motori molecolari (come la \textit{miosina}) e
 filamenti di \textit{actina}.
 Nello studio delle giunzioni cellulari sono ipotizzabili numerosi
 esperimenti in cui uno o più fattori appartenenti ai complessi
@@ -594,26 +627,35 @@ finestre riportate in tabella \ref{tab:fluo_lambda}:
         $\lambda$ eccitazione [\si{nm}] & $\lambda$ emissione [\si{nm}] & Potenza massima [\si{mW}] \\
         \midrule
         \num{488} & \numrange{502.5}{518.5} & \num{1.6}\\
-        \num{532} & \numrange{550.0}{613.0} & \num{1.1}\\
+        \num{532} & \numrange{550.0}{613.0} & \num{5.5}\\
         \num{635} & \numrange{663.0}{700.0} & \num{2.4} \\
         \bottomrule
     \end{tabular}
-    \caption{Lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione compatibili con l'apparato sperimentale, e potenza
-    elettromagnetica totale immessa nel campo visivo.}
+    \caption{Lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione compatibili
+      con l'apparato sperimentale, e potenza elettromagnetica totale
+      immessa nel campo visivo. I valori di potenza massima riportata
+      sono la potenza ottica misurata, attraverso un \textit{power
+        meter}, all'uscita dell'obiettivo, quando le sorgenti laser
+      sono impostate per erogare la massima potenza.}
     \label{tab:fluo_lambda}
 \end{table}
 
-Per ciascuna lunghezza d'onda è possibile ottenere una potenza totale nel campo
-visivo raccolto dal sensore EMCCD $\SI{1}{mW}$.
-Per confrontare le proprietà di fluorofori a diverse lunghezze d'onda scegliamo
-di impostare l'emissione di tutte le sorgenti laser in modo da avere sempre
-$\SI{1}{\mW}$ di potenza ottica sul campione.
-Per rendere uniforme la distribuzione di potenza nel campo visivo si tronca il
-fascio gaussiano prima di focalizzarlo sull'obiettivo a un raggio pari circa
-a 1/15 di quello iniziale (corrispondente alle dimensione del
-campo visivo sul campione).
-In questo modo le deviazione massima d'intensità tra i bordi e il centro
-della regione illuminata è ridotta al \SI{17}{\percent} (figura \ref{fig:flatfield}).
+Per ciascuna lunghezza d'onda è possibile ottenere una potenza totale
+nel campo visivo raccolto dal sensore EMCCD $\SI{1}{mW}$.  Per
+confrontare le proprietà di fluorofori a diverse lunghezze d'onda
+scegliamo di impostare l'emissione di tutte le sorgenti laser in modo
+da avere sempre $\SI{1}{\mW}$ di potenza ottica sul campione.  Per
+rendere uniforme la distribuzione di potenza nel campo visivo si
+tronca il fascio gaussiano prima di focalizzarlo sull'obiettivo a un
+raggio pari circa a 1/4 di quello iniziale (corrispondente alle
+dimensione del campo visivo sul campione). Infatti, il diametro
+misurato prima di focalizzare il fascio sull'obiettivo, di circa
+\SI{2}{\cm}, corrisponde a uno spot sul campione di diametro
+\SI{130}{\um}, circa quattro volte quello dell'area sul campione
+corrispondente alla superficie del sensore della telecamera.  In
+questo modo le deviazione massima d'intensità tra i bordi e il centro
+della regione illuminata è ridotta al \SI{17}{\percent} (figura
+\ref{fig:flatfield}).
 
 \begin{figure}[ht]
     \centering
@@ -761,11 +803,27 @@ laser usato per la fluorescenza, potrebbe diventare significativo l'effetto dell
 di radiazione del fascio obliquo sulle microsfere intrappolate, variando la dinamica delle
 loro fluttuazioni e quindi influenzando la corretta esecuzione del \textit{force-clamp}.
 
+Tuttavia, lo schema HILO ha il grande vantaggio di non richiedere una
+tunabilità fine del laser di eccitazione necessaria per eccitare i
+modi risonanti della microsfera. Abbiamo infatti testato questa
+modalità acquisendo immagini di singoli fluorofori, legati alla
+superficie di microsfere immobilizzate sulla superficie di un vetrino
+coprioggetti e confrontando le immagini ottenute in schema HILO per
+diverse posizioni del piano focale. Il risultato di questo confronto è
+mostrato in figura \ref{fig:bfvshilo}. I singoli fluorofori
+visualizzati nella terza immagine sono quelli che si trovano sulla
+sommità delle microsfere e vengono eccitati dal fascio inclinato
+(HILO), a una distanza di \SI{1.4}{\um} dal piano selezionato
+nell'immagine precedente (b). La regione mostrata, di grandezza
+\SI{40}{\um} x \SI{40}{\um} è stata ottenuta con una potenza ottica
+sul campione di 1mW e un tempo di integrazione di 30ms. Per acquisire
+regioni di interesse molto più piccole, come quella nell’immediata
+prossimità di due proteine interagenti in un esperimento di
+force-clamp, è ragionevole prevedere la possibilità di raggiungere la
+sensibilità di singolo fluoroforo con tempi di integrazione
+dell’ordine del millisecondo.
 
-
-
- 
-\begin{figure}[h]
+\begin{figure}[ht]
 \centering
    \begin{subfigure}{0.45\linewidth}
    \centering
@@ -785,3 +843,10 @@ loro fluttuazioni e quindi influenzando la corretta esecuzione del \textit{force
 TIRF (a) e HILO (b).}
 \label{fig:three_beads}
 \end{figure}
+
+\begin{figure}[ht]
+  \centering
+  \includegraphics[width=0.8\linewidth]{wfvshilo.png}
+  \caption{Fluoroforo Alexa Fluor 647 su microsfere di silice, immobilizzate. Immagini in bright-field (a), HILO al livello della superficie interna del campione (b) e HILO a \SI{1.4}{\um} di profondità (c).}
+  \label{fig:bfvshilo}
+\end{figure}