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chapters/1-introduction.tex

@@ -68,7 +68,7 @@ femtonewton.
 
 Le pinzette ottiche permettono di sondare il comportamento di
 complessi proteici sottoponendo due molecole interagenti a stress
-meccanici controllati e andando ad osservare come la dinamica delle
+meccanici controllati e andando a osservare come la dinamica delle
 interazioni dipenda dalle forze esterne.
 
 Questo tipo di esperimenti si riconduce alle \emph{spettroscopie di forza},
@@ -83,62 +83,65 @@ L'apparato sperimentale descritto in questo lavoro consiste sostanzialmente
 in una ricostruzione di quello utilizzato in \cite{??} per lo studio dei motori
 molecolari per quanto riguarda la componente di spettroscopia di forza, integrato
 con un sistema di microscopia di fluorescenza che consenta di osservare
-simultaneamente la dinamica di singole molecole opp
+simultaneamente la dinamica di singole molecole interagenti con le proteine
+intrappolate.
 
-
-
-
-
-
-Un sistema con queste caratteristiche è stato sviluppato in \cite{},
-utilizzando due pinzette ottiche la cui posizione può essere
-controllata in maniera ultraveloce attraverso modulatori
-acusto-ottici (AOM). In questo modo è 
-intermittenti è necessario che le pinzette ottiche siano
-combinate con tecniche ultraveloci per il posizionamento
-delle trappole e il rilevamento degli spostamenti degli oggetti intrappolati. L'idea alla base di questi
-esperimenti e alcuni esempi sono illustarti in
-sezione \ref{sec:force_clamp}.
-
-Fino a ora il principale limite di questi esperimenti è
+Infatti, fino a ora il principale limite di questi esperimenti è
 stato quello di produrre informazioni dinamiche
-esclusivamente sui due componenti interagenti selezionati,
-trascurando ogni altra possibile interazione.
+esclusivamente sui due componenti interagenti selezionati per la
+spettroscopia di forza, trascurando ogni altra possibile interazione.
 Se in diversi scenari questo è più che sufficiente, alcuni
-sistemi biologici, come le giunzioni cellulari, sono formati da un gran numero di diverse proteine mutualmente
-interagenti.
-
-L'idea alla base di questa tesi è di osservare, durante
-un esperimento di spettroscopia \textit{force-clamp} in
-cui viene applicata una tensione e studiata l'interazione
-tra due proteine appartenenti ad una giunzione cellulare,
-la dinamica dell'interazione con altri fattori che potrebbero svolgere un ruolo importante nella trasduzione dei segnali meccanici.
-
-La strategia scelta per ottenere questo prevede
-di inserire questi fattori aggiunti alla cella di reazione
-per l'esperimento \textit{force-clamp}, opportunamente
-marcati con fluorofori, e di utilizzare opportune
-tecniche di microscopia di fluorescenza per rilevare
-l'interazione di questi fattori liberi in soluzione
-con le proteine immobilizzate.
+sistemi biologici, questo approccio mostra evidenti limiti nello
+studio di una complessa rete di interazioni come quella delle giunzioni
+cellulari.
+
+Un apparato con queste caratteristiche dovrebbe consentire,
+durante un esperimento di spettroscopia di forza, di registrare
+simultaneamente sia la risposta meccanica delle due proteine immobilizzare,
+sia l'eventuale interazione con altri fattori opportunamente marcati presenti
+nella soluzione usata per l'esperimento.
+
 L'ostacolo principale al raggiungimento di questo 
 risultato è dato dalla difficoltà di visualizzare,
 tramite microscopia ottica, l'attività di una singola
-molecola fluorescente legata sopra un fondo di fluorofori
-liberi in soluzione. Per questo motivo è necessario
-utilizzare tecniche che garantiscano un'elevata
-soppressione del rumore di fondo, come la microscopia
-a riflessione interna totale (TIRF, \textit{Total Interal Reflection Fluorescence microscopy}) o la microscopia
-a fogli di luce laminari altamente inclinati (HILO, \textit{Higly Inclined and Laminated Optical sheet microscopy}). Queste tecniche insieme alle basi della
-microscopia di fluorescenza sono descritte nella
-sezione \ref{sec:fluo}.
-
-
-In questo modo sarà possibile studiare, in un ambiente
-controllato (proteine in soluzione e immobilizzate su microsfere), la complessa rete di interazioni che governa
-il funzionamento delle giunzioni cellulari, aggiungendo
-all'informazione \emph{meccanica} su due proteine soggette
-a tensione esterna quella sull'attivaziono o disattivazione del legame con gli altri fattori coinvolti.
+molecola fluorescente sopra un fondo di fluorofori
+liberi in soluzione.
+
+Una soluzione tipicamente adottata prevede l'uso di schemi di
+illuminazione come la riflessione interna totale
+(TIRF, \textit{Total Interal Reflection Fluorescence microscopy})
+o i fogli di luce inclinati (HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet microscopy}), in modo da ridurre il volume di campione eccitato e quindi l'emissione
+di fluorescenza di fondo.
+
+Questi schemi di illuminazione però richiedono che il volume osservato
+sia nelle immediate vicinanze della superficie del vetrino coprioggetti usato
+per la preparazione del campione, condizione che è impossibile realizzare negli
+esperimenti di spettroscopia di forza, dove le proteine vengono funzionalizzate su sfere dielettriche di dimensioni micrometriche. In questo caso infatti il volume di campione
+dove si trovano le proteine interagenti ha uno quota significativa (diverse centinaia di
+micrometri) rispetto al vetrino coprioggetti.
+
+Scopo dell'apparato sperimentale sarà anche studiare la possibilità di superare
+questo limite usando la sfera dielettrica come risuonatore ottico, e quindi come
+strumento in grado di trasferire la radiazione di eccitazione dall'immediata prossimità
+del vetrino coprioggetti ai fluorofori presenti in prossimità del sito di interazione.
+In questo modo il segnale proveniente da molecole fuori fuoco, lontane dalla microsfera,
+sarebbe efficaciemente soppresso.
+
+Nelle prossime sezioni è possibile trovare una trattazione più approfondita degli
+argomenti introdotti, in particolare nella sezione \ref{sec:giunzioni} vengono introdotti
+due importanti tipologie di giunzioni cellulari particolarmente interessanti
+per studio con un sistema combinato come quello qui descritto.
+Nella sezione \ref{sec:ot} vengono trattate in maniera più approfondita le pinzette
+ottiche e la loro applicazione agli esperimenti di spettroscopia di forza.
+Nella sezione \ref{sec:fluo} vengono introdotti i principali limiti della microscopia di fluorescenza e le soluzioni proposte per il loro superamento.
+
+Nel capitolo \ref{cap:methods} vengono descritte nel dettaglio le caratteristiche
+dell'apparato sperimentale realizzato e le procedure di validazione, calibrazione e 
+acquisizione dei dati.
+
+Nel capitolo \ref{cap:results} sono analizzati i dati prodotti durante le operazioni
+di validazione dell'apparato sperimentale e delle procedure di misura per valutare
+le prestazioni ottenibili e la loro adeguatezza agli esperimenti ipotizzati.
 
 
 % Introduction on the importance of mechanotransduction
@@ -291,8 +294,8 @@ in un fluido. L'interazione delle particelle con la radiazione fa si
 che queste risentano di una forza di richiamo verso una posizione
 di equilibrio in prossimità del fuoco del fascio.
 
-Fin dalla loro ideazione furono subito messe in luci le potenzialità
-di questa tecnica nella manipolazione di campioni biologici.
+Fin dalla loro ideazione vennero subito messe in luce le potenzialità
+di questa tecnica quando applicata alla manipolazione di campioni biologici.
 
 Arthur Ashkin fu, nel 1986, il primo a realizzare sperimentalmente delle pinzette ottiche, riuscendo a intrappolare microsfere sintetiche e batteri\cite{Ashkin:86}. Per questo risultato gli fu conferito il premio Nobel nel 2018, \emph{``per le pinzette ottiche e le loro applicazioni ai sistemi biologici''}.
 
@@ -410,7 +413,7 @@ Il risultato netto dei due contributi è che la microsfera tendera ad occupare u
 posizione di equilibrio nel punto in cui i due contributi si cancellano e, se
 perturbata, risentirà di una forza di richiamo verso la posizione di equilibrio.
 
-Una risultato qualitativamente identico è dimostrabile nel limite dell'ottica
+Un risultato qualitativamente identico è dimostrabile nel limite dell'ottica
 geometrica, quando la particella è al contrario di dimensioni molto maggiori
 alla lunghezza d'onda intermedia.
 
@@ -432,4 +435,18 @@ Il valore di $k$ per una certa trappola ottica, come vedremo, può essere
 determinato attraverso un'apposita procedura di calibrazione che sfrutta
 la diffusione della microsfera all'interno della trappola.
 
+Inoltre è necessario considerare l'effetto degli urti con le molecole della
+soluzione liquida in cui la sfera è immersa, che hanno i due seguenti effetti:
+\begin{itemize}
+    \item La presenza di un attrito viscoso, proporzionale alla velocità relativa
+    della sfera rispetto al fluido
+    \item La fluttuazione della sfera rispetto alla posizione di equilibrio (moto browniano).
+\end{itemize}
+
+Grazie alla termodinamica statistica è possibile mettere in relazione lo spettro
+delle fluttuazioni di posizione di una sfera intrappolata con il parametro $k$ della
+forza elastica di richiamo. In questo modo, una volta determinato $k$, è possibile mettere
+in relazione il valore delle forze esterne agenti sulla sfera con il suo 
+
+
 \section{Microscopia di fluorescenza}