diff --git a/chapters/1-introduction.tex b/chapters/1-introduction.tex index 18a4ce3..0ea4929 100644 --- a/chapters/1-introduction.tex +++ b/chapters/1-introduction.tex @@ -68,7 +68,7 @@ femtonewton. Le pinzette ottiche permettono di sondare il comportamento di complessi proteici sottoponendo due molecole interagenti a stress -meccanici controllati e andando ad osservare come la dinamica delle +meccanici controllati e andando a osservare come la dinamica delle interazioni dipenda dalle forze esterne. Questo tipo di esperimenti si riconduce alle \emph{spettroscopie di forza}, @@ -83,62 +83,65 @@ L'apparato sperimentale descritto in questo lavoro consiste sostanzialmente in una ricostruzione di quello utilizzato in \cite{??} per lo studio dei motori molecolari per quanto riguarda la componente di spettroscopia di forza, integrato con un sistema di microscopia di fluorescenza che consenta di osservare -simultaneamente la dinamica di singole molecole opp +simultaneamente la dinamica di singole molecole interagenti con le proteine +intrappolate. - - - - - -Un sistema con queste caratteristiche è stato sviluppato in \cite{}, -utilizzando due pinzette ottiche la cui posizione può essere -controllata in maniera ultraveloce attraverso modulatori -acusto-ottici (AOM). In questo modo è -intermittenti è necessario che le pinzette ottiche siano -combinate con tecniche ultraveloci per il posizionamento -delle trappole e il rilevamento degli spostamenti degli oggetti intrappolati. L'idea alla base di questi -esperimenti e alcuni esempi sono illustarti in -sezione \ref{sec:force_clamp}. - -Fino a ora il principale limite di questi esperimenti è +Infatti, fino a ora il principale limite di questi esperimenti è stato quello di produrre informazioni dinamiche -esclusivamente sui due componenti interagenti selezionati, -trascurando ogni altra possibile interazione. +esclusivamente sui due componenti interagenti selezionati per la +spettroscopia di forza, trascurando ogni altra possibile interazione. Se in diversi scenari questo è più che sufficiente, alcuni -sistemi biologici, come le giunzioni cellulari, sono formati da un gran numero di diverse proteine mutualmente -interagenti. - -L'idea alla base di questa tesi è di osservare, durante -un esperimento di spettroscopia \textit{force-clamp} in -cui viene applicata una tensione e studiata l'interazione -tra due proteine appartenenti ad una giunzione cellulare, -la dinamica dell'interazione con altri fattori che potrebbero svolgere un ruolo importante nella trasduzione dei segnali meccanici. - -La strategia scelta per ottenere questo prevede -di inserire questi fattori aggiunti alla cella di reazione -per l'esperimento \textit{force-clamp}, opportunamente -marcati con fluorofori, e di utilizzare opportune -tecniche di microscopia di fluorescenza per rilevare -l'interazione di questi fattori liberi in soluzione -con le proteine immobilizzate. +sistemi biologici, questo approccio mostra evidenti limiti nello +studio di una complessa rete di interazioni come quella delle giunzioni +cellulari. + +Un apparato con queste caratteristiche dovrebbe consentire, +durante un esperimento di spettroscopia di forza, di registrare +simultaneamente sia la risposta meccanica delle due proteine immobilizzare, +sia l'eventuale interazione con altri fattori opportunamente marcati presenti +nella soluzione usata per l'esperimento. + L'ostacolo principale al raggiungimento di questo risultato è dato dalla difficoltà di visualizzare, tramite microscopia ottica, l'attività di una singola -molecola fluorescente legata sopra un fondo di fluorofori -liberi in soluzione. Per questo motivo è necessario -utilizzare tecniche che garantiscano un'elevata -soppressione del rumore di fondo, come la microscopia -a riflessione interna totale (TIRF, \textit{Total Interal Reflection Fluorescence microscopy}) o la microscopia -a fogli di luce laminari altamente inclinati (HILO, \textit{Higly Inclined and Laminated Optical sheet microscopy}). Queste tecniche insieme alle basi della -microscopia di fluorescenza sono descritte nella -sezione \ref{sec:fluo}. - - -In questo modo sarà possibile studiare, in un ambiente -controllato (proteine in soluzione e immobilizzate su microsfere), la complessa rete di interazioni che governa -il funzionamento delle giunzioni cellulari, aggiungendo -all'informazione \emph{meccanica} su due proteine soggette -a tensione esterna quella sull'attivaziono o disattivazione del legame con gli altri fattori coinvolti. +molecola fluorescente sopra un fondo di fluorofori +liberi in soluzione. + +Una soluzione tipicamente adottata prevede l'uso di schemi di +illuminazione come la riflessione interna totale +(TIRF, \textit{Total Interal Reflection Fluorescence microscopy}) +o i fogli di luce inclinati (HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet microscopy}), in modo da ridurre il volume di campione eccitato e quindi l'emissione +di fluorescenza di fondo. + +Questi schemi di illuminazione però richiedono che il volume osservato +sia nelle immediate vicinanze della superficie del vetrino coprioggetti usato +per la preparazione del campione, condizione che è impossibile realizzare negli +esperimenti di spettroscopia di forza, dove le proteine vengono funzionalizzate su sfere dielettriche di dimensioni micrometriche. In questo caso infatti il volume di campione +dove si trovano le proteine interagenti ha uno quota significativa (diverse centinaia di +micrometri) rispetto al vetrino coprioggetti. + +Scopo dell'apparato sperimentale sarà anche studiare la possibilità di superare +questo limite usando la sfera dielettrica come risuonatore ottico, e quindi come +strumento in grado di trasferire la radiazione di eccitazione dall'immediata prossimità +del vetrino coprioggetti ai fluorofori presenti in prossimità del sito di interazione. +In questo modo il segnale proveniente da molecole fuori fuoco, lontane dalla microsfera, +sarebbe efficaciemente soppresso. + +Nelle prossime sezioni è possibile trovare una trattazione più approfondita degli +argomenti introdotti, in particolare nella sezione \ref{sec:giunzioni} vengono introdotti +due importanti tipologie di giunzioni cellulari particolarmente interessanti +per studio con un sistema combinato come quello qui descritto. +Nella sezione \ref{sec:ot} vengono trattate in maniera più approfondita le pinzette +ottiche e la loro applicazione agli esperimenti di spettroscopia di forza. +Nella sezione \ref{sec:fluo} vengono introdotti i principali limiti della microscopia di fluorescenza e le soluzioni proposte per il loro superamento. + +Nel capitolo \ref{cap:methods} vengono descritte nel dettaglio le caratteristiche +dell'apparato sperimentale realizzato e le procedure di validazione, calibrazione e +acquisizione dei dati. + +Nel capitolo \ref{cap:results} sono analizzati i dati prodotti durante le operazioni +di validazione dell'apparato sperimentale e delle procedure di misura per valutare +le prestazioni ottenibili e la loro adeguatezza agli esperimenti ipotizzati. % Introduction on the importance of mechanotransduction @@ -291,8 +294,8 @@ in un fluido. L'interazione delle particelle con la radiazione fa si che queste risentano di una forza di richiamo verso una posizione di equilibrio in prossimità del fuoco del fascio. -Fin dalla loro ideazione furono subito messe in luci le potenzialità -di questa tecnica nella manipolazione di campioni biologici. +Fin dalla loro ideazione vennero subito messe in luce le potenzialità +di questa tecnica quando applicata alla manipolazione di campioni biologici. Arthur Ashkin fu, nel 1986, il primo a realizzare sperimentalmente delle pinzette ottiche, riuscendo a intrappolare microsfere sintetiche e batteri\cite{Ashkin:86}. Per questo risultato gli fu conferito il premio Nobel nel 2018, \emph{``per le pinzette ottiche e le loro applicazioni ai sistemi biologici''}. @@ -410,7 +413,7 @@ Il risultato netto dei due contributi è che la microsfera tendera ad occupare u posizione di equilibrio nel punto in cui i due contributi si cancellano e, se perturbata, risentirà di una forza di richiamo verso la posizione di equilibrio. -Una risultato qualitativamente identico è dimostrabile nel limite dell'ottica +Un risultato qualitativamente identico è dimostrabile nel limite dell'ottica geometrica, quando la particella è al contrario di dimensioni molto maggiori alla lunghezza d'onda intermedia. @@ -432,4 +435,18 @@ Il valore di $k$ per una certa trappola ottica, come vedremo, può essere determinato attraverso un'apposita procedura di calibrazione che sfrutta la diffusione della microsfera all'interno della trappola. +Inoltre è necessario considerare l'effetto degli urti con le molecole della +soluzione liquida in cui la sfera è immersa, che hanno i due seguenti effetti: +\begin{itemize} + \item La presenza di un attrito viscoso, proporzionale alla velocità relativa + della sfera rispetto al fluido + \item La fluttuazione della sfera rispetto alla posizione di equilibrio (moto browniano). +\end{itemize} + +Grazie alla termodinamica statistica è possibile mettere in relazione lo spettro +delle fluttuazioni di posizione di una sfera intrappolata con il parametro $k$ della +forza elastica di richiamo. In questo modo, una volta determinato $k$, è possibile mettere +in relazione il valore delle forze esterne agenti sulla sfera con il suo + + \section{Microscopia di fluorescenza} \ No newline at end of file