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@ -8,8 +8,8 @@ ruolo importante nel determinare il corretto funzionamento di cellule, |
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tessuti e organismi complessi. |
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Mentre tradizionalmente la biologia si è occupata di studiare come |
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processi cellulari e intercellulari fossero regolati dallo scambio |
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di molecole biologiche, il ruolo degli stimoli meccanici è stato a |
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processi cellulari e intercellulari fossero regolati dalle reazioni |
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biochimiche e dalla genetica, il ruolo degli stimoli meccanici è stato a |
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lungo ritenuto marginale nella descrizione di questi processi. |
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Lo sviluppo di tecniche sempre più avanzate e precise per la |
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@ -95,15 +95,15 @@ Infatti, fino a ora il principale limite di questi esperimenti è |
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stato quello di produrre informazioni dinamiche |
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esclusivamente sui due componenti interagenti selezionati per la |
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spettroscopia di forza, trascurando ogni altra possibile interazione. |
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Se in diversi scenari questo è più che sufficiente, alcuni |
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|
Se in diversi scenari questo è più che sufficiente, in alcuni |
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sistemi biologici, questo approccio mostra evidenti limiti nello |
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studio di una complessa rete di interazioni come quella delle |
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|
|
studio di una complessa rete di interazioni, come quella delle |
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giunzioni cellulari. |
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Un apparato con queste caratteristiche dovrebbe consentire, |
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durante un esperimento di spettroscopia di forza, di registrare |
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simultaneamente sia la risposta meccanica delle due proteine |
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immobilizzare, sia l'eventuale interazione con altri fattori |
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immobilizzate, sia l'eventuale interazione con altri fattori |
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opportunamente marcati presenti nella soluzione usata per |
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l'esperimento. |
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@ -125,18 +125,18 @@ Questi schemi di illuminazione però richiedono requisiti molto |
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stringenti. |
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Ad esempio per poter utilizzare la TIRF, come approfondito in sezione |
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\ref{sec:fluo} è necessario che il volume osservato sia nelle |
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immediate vicinanze della superficie del vetrino |
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immediate vicinanze (poche centinaia di nanometri) della superficie del vetrino |
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coprioggetti usato per la preparazione del campione, |
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condizione che è impossibile realizzare negli esperimenti di |
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spettroscopia di forza, dove le proteine vengono funzionalizzate su |
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sfere dielettriche di dimensioni micrometriche. |
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sfere di silice di dimensioni micrometriche. |
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In questo caso infatti il volume di campione |
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dove si trovano le proteine interagenti ha uno quota significativa |
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(diverse centinaia di micrometri) rispetto al vetrino coprioggetti. |
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dove si trovano le proteine interagenti è posto a una quota significativa |
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rispetto alla zona illuminata nelle vicinanze del vetrino coprioggetti. |
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Scopo dell'apparato sperimentale sarà anche studiare la possibilità di |
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superare questo limite usando la sfera dielettrica come risuonatore |
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ottico, e quindi come strumento in grado di trasferire la radiazione |
|
|
|
o foceggiatore ottico, e quindi come strumento in grado di trasferire la radiazione |
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di eccitazione dall'immediata prossimità del vetrino coprioggetti ai |
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fluorofori presenti in prossimità del sito di interazione. |
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In questo modo il segnale proveniente da molecole fuori fuoco, |
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@ -233,12 +233,12 @@ con il citoscheletro. É stato scoperto |
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\emph{vinculina} e \emph{$\alpha$-actinina} svolgono questa attività. |
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|
Sebbene la funzione di questi collegamenti indiretti non sia stata |
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|
|
ancora del tutto compresa, è stato dimostrato che la sua presenza |
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|
|
delle proteine responsabili è fondamentale per il corretto sviluppo |
|
|
|
ancora del tutto compresa, è stato dimostrato che la presenza |
|
|
|
delle proteine responsabili di tali collegamenti è fondamentale per il corretto sviluppo |
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|
dei tessuti. |
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|
Esperimenti su colture cellulari in il gene che codifica l'espressione |
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|
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Esperimenti su colture cellulari in cui il gene che codifica l'espressione |
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della vinculina è stato rimosso suggeriscono come, oltre ad una |
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riduzione generale dell'adesione tra cellule, si perda alcune funzioni |
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|
|
riduzione generale dell'adesione tra cellule, si perdano alcune funzioni |
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di regolazione |
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e modulazione dell'attività delle giunzioni. |
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@ -287,7 +287,7 @@ tra un certo numero di proteine interagenti. |
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Diverse proteine attraversano la membrana e dimerizzano con le loro |
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|
omologhe appartenenti alla cellula adiacente, tra le quali |
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\emph{claudina}, \emph{occludina} e diverse proteine appartenenti |
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|
alla classe delle \textit{junctional adhesion molecules}, (JAM). |
|
|
|
alla classe delle \textit{junctional adhesion molecules} (JAM). |
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|
|
Queste proteine di membrana si legano alla proteina \textit{Zona |
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occludens 1}, ZO-1 che, come mostrato da recenti studi |
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|
|
\cite{Vasileva2020}, |
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@ -297,7 +297,7 @@ Inoltre vi sono evidenze sul ruolo di una terza proteina, la |
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\textit{cingulina}, nel modulare l'interazione di ZO-1 con il |
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citoscheletro di actina. Un'ipotesi è che il legame cingulina-ZO-1 |
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possa indurre delle modifiche conformazionali in ZO-1 tali da |
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consentire un legame diretto con in filamenti di actina. |
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|
|
consentire un legame diretto con i filamenti di actina. |
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|
Anche in questo caso, per comprendere il ruolo della cingulina nella |
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|
trasduzione dei segnali meccanici, sembra promettente utilizzare una |
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tecnica che consenta, durante l'osservazione dell'interazione di due |
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@ -338,8 +338,8 @@ applicazioni ai sistemi biologici''}. |
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Grazie alle pinzette ottiche è possibile intrappolare solidi |
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dielettrici di diversa dimensione e natura. |
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|
Per ottenere la capacità di manipolare individualmente singole |
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molecole, come le proteine non è possibile procedere ad un |
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intrappolamento diretto. |
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molecole, come le proteine in una soluzione acquosa a temperatura ambiente, |
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|
non è possibile procedere ad un intrappolamento diretto. |
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Si rende necessario quindi sviluppare protocolli per funzionalizzare |
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|
la superficie di sfere dielettriche e legarci le molecole che |
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@ -347,14 +347,14 @@ intendiamo studiare. |
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Tipicamente esperimenti di questo tipo vengono realizzati utilizzando |
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sfere dielettriche di dimensioni micrometriche funzionalizzate legando |
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covalentemente molecole di \textit{streptavidina} alla loro |
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superficie. |
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covalentemente le proteine o le molecole biologiche di interesse. |
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|
In alternativa, vengono legate sulla superficie delle microsfere molecole di |
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\textit{streptavidina}. |
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|
In questo modo è possibile successivamente ottenere il legame delle |
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|
|
microsfere col polimero biologico d'interesse, purché esso sia stato |
|
|
|
preventivamente legato a molecole di biotina (biotilinato). |
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|
Si sfrutta in questo modo il legame streptavidina-biotina, estremamente stabile e praticamente |
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irreversibile (vedi figura \ref{fig:biotin-streptavidin}). |
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|
microsfere col polimero biologico o la proteina d'interesse, purché essi siano stati |
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|
preventivamente biotilinati. |
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|
|
Si sfrutta in questo modo il legame streptavidina-biotina, estremamente stabile nei tempi |
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|
|
tipici di un esperimento di singola molecola (vedi figura \ref{fig:biotin-streptavidin}). |
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\begin{figure}[ht] |
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|
|
\centering |
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@ -377,11 +377,11 @@ col campo elettromagnetico può essere scomposta in due contributi: |
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\item La \textbf{forza di \textit{scattering}} o pressione di |
|
|
|
radiazione, sempre orientata nella direzione di propagazione |
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|
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della radiazione e proporzionale alla sua intesità. |
|
|
|
\item La \textbf{forza di dipolo} o gradiente, proporzionale |
|
|
|
al gradiente d'intensità della radiazione elettromagnetico. |
|
|
|
\item La \textbf{forza di gradiente}, proporzionale |
|
|
|
al gradiente d'intensità della radiazione elettromagnetica. |
|
|
|
\end{itemize} |
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|
L'origine di questi due contributi e la dipenza dalle caratteristiche |
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|
L'origine di questi due contributi e la dipendenza dalle caratteristiche |
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|
della microsfera e del liquido utilizzati possono essere derivate |
|
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|
analiticamente dalle equazioni di Maxwell nei limiti del regime |
|
|
|
di Rayleigh, ovvero quando le dimensioni della sfera sono molto |
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@ -390,23 +390,30 @@ inferiori alla lunghezza d'onda della radiazione utilizzata. |
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|
In questo limite possiamo considerare il materiale interagente con la |
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|
radiazione come un dipolo elettrico puntiforme, associato ad una |
|
|
|
polarizzabilità $\alpha$. Il vettore di polarizzazione nel dipolo |
|
|
|
puntiforme sarà quindi $\vec{p} = \alpha \vec{E}$. |
|
|
|
puntiforme sarà quindi $\vec{p} = \alpha \vec{E}$, dove il vettore $\vec{E}$ |
|
|
|
è il campo elettrico che induce la polarizzazione. |
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|
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|
La pressione di radiazione sarà quindi proporzionale all'impulso |
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dei fotoni retrodiffusi per \textit{scattering} Rayleigh. |
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|
|
Nel caso di una microsfera di raggio $a$, indice di rifrazione $n$, |
|
|
|
immersa in un fluido con indice di rifrazione $m$, la forza di |
|
|
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investita da un'onda piana di intensità $I_0$, vettore d'onda $\vec{k}$ |
|
|
|
e immersa in un fluido con indice di rifrazione $m$, la forza di |
|
|
|
\textit{scattering} può essere espressa\cite{HARADA1996529} come: |
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|
|
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|
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|
\begin{equation} |
|
|
|
\vec{F}_r = \hat{k} \frac{8 \pi n k^4 a^6}{3c} |
|
|
|
\vec{F}_r = \hat{k} I_0 \frac{8 \pi n k^4 a^6}{3c} |
|
|
|
\left( |
|
|
|
\frac{(n/m)^2 - 1}{(n/m)^2 + 2} |
|
|
|
\right)^2 |
|
|
|
\end{equation} |
|
|
|
|
|
|
|
L'espressione della forza gradiente può essere ottenuta |
|
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|
dall'interazione lorentziana tra la radiazione e il dipolo puntiforme: |
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|
|
Dove $c$ è la velocità della luce nel vuoto. |
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|
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|
|
L'espressione della forza di gradiente può essere ottenuta |
|
|
|
dall'interazione lorentziana tra la radiazione e il dipolo puntiforme. |
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|
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|
|
Infatti, se $\vec{p}$ è il vettore di polarizzazione e $\vec{E}, \vec{B}$ sono |
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i vettori dei campi elettrici e magnetici della radiazione, abbiamo: |
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$$ \vec{F}_g = |
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\left( |
|
|
|
@ -427,35 +434,32 @@ $$ \vec{F}_g = |
|
|
|
$$ |
|
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|
|
|
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|
E infine, tenendo conto delle \emph{equazioni di Maxwell} e |
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dell'algebra dei vettori: |
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dell'algebra dei vettori, e mediando su un periodo di oscillazione, otteniamo: |
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\begin{equation} |
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|
\label{dipole_force} |
|
|
|
\vec{F_g} = |
|
|
|
\alpha |
|
|
|
\alpha |
|
|
|
\left[ |
|
|
|
\frac{1}{2}\nabla E^2 |
|
|
|
+ \frac{d}{dt}\left(\vec{E} \times \vec{B}\right) |
|
|
|
\right] |
|
|
|
\end{equation} |
|
|
|
|
|
|
|
Questa ultima forma (equazione \ref{dipole_force}) ci permette di |
|
|
|
mettere in evidenza il termine $\frac{d}{dt}(\vec{E} \times \vec{B})$, |
|
|
|
ovvero la derivata temporale di una quantità oscillante molto |
|
|
|
Il termine dipendente dal campo magnetico è la derivata di una quantità che cambia |
|
|
|
rapidamente (\SI{> 1e14}{\Hz}), che |
|
|
|
può tranquillamente essere considerata costante se confrontata con in |
|
|
|
tempi tipici dell'evoluzione meccanica del sistema. |
|
|
|
Il secondo termine può quindi essere trascurato e, sostituendo ad |
|
|
|
può tranquillamente essere considerata nulla se confrontata con in |
|
|
|
tempi tipici dell'evoluzione meccanica del sistema, e può quindi essere trascurato. |
|
|
|
Sostituendo ad |
|
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|
$\alpha$ l'espressione per la polarizzabilità della microsfera |
|
|
|
otteniamo: |
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|
|
|
|
|
|
\begin{equation} |
|
|
|
\vec{F}_g = |
|
|
|
\frac{2\pi n a^3}{c} |
|
|
|
\vec{F}_g = |
|
|
|
\frac{2\pi a^3}{c} |
|
|
|
\left( |
|
|
|
\frac{(n/m)^2 - 1}{(n/m)^2 + 2} |
|
|
|
\right) |
|
|
|
\nabla I(\vec{r}) |
|
|
|
\nabla I_0(\vec{r}) |
|
|
|
\end{equation} |
|
|
|
|
|
|
|
Il risultato netto dei due contributi è che la microsfera tenderà ad |
|
|
|
@ -468,7 +472,7 @@ dell'ottica geometrica, quando la particella è al contrario di |
|
|
|
dimensioni molto maggiori alla lunghezza d'onda intermedia. |
|
|
|
|
|
|
|
Il caso intermedio richiede l'uso della più complessa teoria |
|
|
|
Lorenz-Mie e spesso il ricorso a soluzioni numeriche, ma l'idea |
|
|
|
Lorenz-Mie e il ricorso a soluzioni numeriche, ma l'idea |
|
|
|
qualitativa alla base dell'intrappolamento resta valida. |
|
|
|
|
|
|
|
Nel caso generale i requisiti per un intrappolamento efficace sono |
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|
@ -476,13 +480,24 @@ quelli di avere una forza di gradiente maggiore di quella di |
|
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|
scattering e una energia cinetica delle particelle intrappolate |
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|
sufficientemente bassa (quindi un fluido sufficientemente viscoso). |
|
|
|
|
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|
Per le nostre applicazioni è sufficiente considerare una forza di |
|
|
|
richiamo del tipo |
|
|
|
Per le nostre applicazioni è sufficiente considerare, su un piano |
|
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|
perpendicolare alla dirazione di propagazione del fascio, una forza di |
|
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|
richiamo del tipo: |
|
|
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\begin{equation} |
|
|
|
\vec{F} = -k(\vec{x}-\vec{x}_{eq}) |
|
|
|
\vec{F}_\perp = -k_{\perp}(\vec{x}_{\perp}-\vec{x}_{\perp,eq}) |
|
|
|
\end{equation} |
|
|
|
|
|
|
|
Dove $\vec{x}_{\perp}$ è la proiezione della posizione della particella |
|
|
|
intrappolata sul piano considerato, $\vec{x}_{\perp.eq}$ è la posizione di equilibrio, |
|
|
|
corrispondente al centro della fascio in assenza di forze esterne, e $k_{\perp}$ è |
|
|
|
la costante elastica relativa alla forza di richiamo sul piano perpendicolare. |
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Lungo la direzione assiale la particella sarà analogamente confinata ma con un costante |
|
|
|
elastica minore e variabile con la posizione. In particolare il suo valore non sarà |
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|
simmetrico rispetto al fuoco del fascio quando si considera il contributo aggiuntivo |
|
|
|
della forza di scattering. |
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|
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|
\begin{figure}[ht] |
|
|
|
\centering |
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|
\includegraphics[scale=.4]{images/fkx.pdf} |
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|
@ -504,8 +519,10 @@ seguenti effetti: |
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|
|
equilibrio (moto browniano). |
|
|
|
\end{itemize} |
|
|
|
|
|
|
|
Grazie alla termodinamica statistica è possibile mettere in relazione |
|
|
|
lo spettro delle fluttuazioni di posizione di una sfera intrappolata |
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|
Riuscendo a misurare le fluttuazioni della posizione della sfera intrappolata, |
|
|
|
con un sistema come quello descritto in sezione \ref{sec:tweezer}, è possibile |
|
|
|
sfruttare la termodinamica statistica per mettere in relazione |
|
|
|
lo spettro di queste |
|
|
|
con il parametro $k$ della forza elastica di richiamo |
|
|
|
(vedi sezione \ref{sec:calibration}). |
|
|
|
In questo modo, una volta determinato $k$, è possibile mettere |
|
|
|
@ -513,25 +530,30 @@ in relazione il valore delle forze esterne agenti sulla sfera con il |
|
|
|
suo spostamento dalla posizione di riposo. |
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|
|
|
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|
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|
\section{Microscopia di fluorescenza di singola molecola} |
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|
\label{sec:fluo} |
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|
% come evitare ripetizione "singola(e) molecola(e)" |
|
|
|
Tipicamente, le tecniche di microscopia di fluorescenza di singola |
|
|
|
molecola consentono di sondare la posizione e i movimenti di singole |
|
|
|
molecole con risoluzioni spaziali e temporali prossime, |
|
|
|
rispettivamente, al nanometro e al millisecondo. |
|
|
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|
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|
|
In ambito biologico le molecole che vengono osservate con questa |
|
|
|
tecniche sono polimeri di varia natura, come proteine e acidi |
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|
|
Le tecniche di microscopia di fluorescenza di singola molecola consentono |
|
|
|
di sondare la posizione e i movimenti di singole molecole con risoluzioni |
|
|
|
spaziali e temporali che dipendono dalla tipologia di cromofori utilizzati. |
|
|
|
Tipicamente, usando cromofori standard, si riesce ad arrivare a risoluzioni |
|
|
|
spaziali di decine di nanometri con un tempo di integrazione di circa \SI{10}{\ms}. |
|
|
|
Per avvicinarsi a una risoluzione spaziale di \SI{1}{\nm} è necessario aumentare |
|
|
|
il tempo di integrazione fino ad almeno \SI{1}{\s}. |
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|
|
|
In ambito biologico le molecole che vengono osservate con queste |
|
|
|
tecniche sono di varia natura, ad esempio proteine o acidi |
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|
|
nucleici. Anche se alcune di queste molecole possono avere una |
|
|
|
debole fluorescenza intrinseca, si fa quasi sempre ricorso alla |
|
|
|
marcatura con fluorofori, cioè molecole con caratteristiche di |
|
|
|
fluorescenza note e elevata resa quantica. In questo modo è |
|
|
|
possibile ottenere livelli di segnale maggiori e soprattutto |
|
|
|
possibile ottenere livelli di segnale maggiori e soprattutto |
|
|
|
un'elevata specificità nel rendere rilevabili solo le molecole |
|
|
|
che presentano caratteristiche di interesse. |
|
|
|
Queste due proprietà sono, come vedremo, molto importanti per |
|
|
|
Queste due proprietà sono, come vedremo, molto importanti per riuscire |
|
|
|
a rivelare singole molecole biologiche e per |
|
|
|
raggiungere una buona precisione di localizzazione. |
|
|
|
|
|
|
|
Le tecniche di microscopia di fluorescenza sono molto flessibili |
|
|
|
@ -569,15 +591,15 @@ standardizzati. La scelta del fluoroforo e del protocollo di marcatura |
|
|
|
devono tener conto di numerosi fattori, tra i quali: le condizioni |
|
|
|
dell'esperimento (in vivo o in vitro), le possibili interferenze col |
|
|
|
comportamento del sistema studiato, la compatibilità con le sostanze |
|
|
|
chimiche usate in soluzione, la stabilità del fluoroforo stesso e il |
|
|
|
chimiche usate in soluzione, la stabilità del fluoroforo stesso e il |
|
|
|
suo tempo di vita. |
|
|
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|
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|
Per la produzione delle immagini esistono due macro-categorie di |
|
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|
tecniche: le microscopie a campo largo (o \textit{wide-field}) e |
|
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|
le miscroscopie a scansione puntiforme. |
|
|
|
le microscopie a scansione puntiforme. |
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|
|
Nel primo caso l'intero volume osservato viene illuminato |
|
|
|
uniformemente e la radiazione emessa per fluorescenza viene raccolta |
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|
|
e ingrandita da un opportuno cammino ottico che ricostruisce |
|
|
|
e ingrandita da un opportuno sistema ottico che ricostruisce |
|
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|
l'immagine sulla matrice di un sensore CMOS o CCD. |
|
|
|
Nel secondo caso l'area di interesse viene suddivisa in un reticolo |
|
|
|
tridimensionale di punti e ogni punto viene acquisito sequenzialmente, |
|
|
|
@ -587,7 +609,7 @@ unico punto, coincidente con l'apertura di un fotodiodo o di un |
|
|
|
fotomoltiplicatore. |
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|
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|
|
|
|
Il principale vantaggio delle tecniche a scansione rispetto a quelle |
|
|
|
a campo largo risiede in una più marcata soppressione del |
|
|
|
a campo largo risiede, solitamente, in una più marcata soppressione del |
|
|
|
rumore di fondo dovuto all'emissione di fluorescenza fuori dal |
|
|
|
piano focale. I microscopi che sfruttano queste tecniche sono infatti |
|
|
|
equipaggiati di opportuni accorgimenti per filtrare sia la radiazione |
|
|
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@ -608,11 +630,11 @@ decresce all'aumentare delle dimensioni dell'area osservata e della |
|
|
|
densità di punti acquisita. |
|
|
|
|
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La microscopia a campo largo, acquisendo simultaneamente tutto il |
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fotogramma in una sola volta, consente di raggiungere risoluzioni |
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campo visivo in una sola volta, consente di raggiungere risoluzioni |
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temporali molto elevate anche per campioni estesi. La velocità |
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di acquisizione di un singolo fotogramma è essenzialmente limitata |
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dalla sensibilità del sensore usato e dalla velocità della sua scheda |
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elettronica. |
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dalla sensibilità del sensore usato e dalla velocità di trasferimento |
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dei dati. |
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Tuttavia, in questo caso, sul sensore si va a sommare all'immagine |
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proveniente dai fluorofori nel piano focale quella, fuori fuoco, |
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di tutti gli emettitori che si trovano su piani diversi attraversati |
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@ -628,11 +650,11 @@ manipolando il fascio di eccitazione, consentono di ridurre lo |
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spessore del volume di campione eccitato, come la microscopia a |
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riflessione interna totale |
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(TIRF, \textit{Total Internal Reflection Fluorescence microscopy}) |
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o quella a fogli di luce inclinati |
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o quella a foglio di luce inclinato |
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(HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet |
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microscopy}). |
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Grazie a queste due tecniche è possibile ottenere una sensibilità |
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di singola molecola a una risoluzione temporale nell'ordine dei |
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di singola molecola con una risoluzione temporale nell'ordine dei |
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millisecondi, rendendo possibile ad esempio il tracciamento |
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degli spostamenti di una proteina. |
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@ -647,7 +669,10 @@ campione. |
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L'onda evanescente viene ottenuta facendo incidere il fascio |
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di eccitazione all'interfaccia di separazione tra il vetrino |
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coprioggetti e il campione con un angolo maggiore rispetto |
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all'angolo critico $\theta_c$ definito dalla \emph{legge di Snell}: |
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all'angolo critico $\theta_c$ definito dalla \emph{legge di Snell}. |
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Un fascio che incide sulla superficie di separazione tra due mezzi con |
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indice di rifrazione $n_i$ e $n_t$, con un angolo rispetto alla normale |
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$\theta_i$, verrà rifratto a un angolo $\theta_r$ definito dalla relazione: |
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\begin{multline} |
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n_i \sin(\theta_i) = n_t \sin(\theta_t) \\ |
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@ -666,7 +691,7 @@ reale, si può avere \emph{riflessione interna totale} se l'angolo |
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di incidenza è superiore a $\theta_c$. |
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In queste condizioni tutta l'energia dell'onda incidente viene |
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riflessa nel primo mezzo e non si ha la formazione di un raggio |
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trasmesso nel secondo. |
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rifratto nel secondo. |
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Per studiare le caratteristiche dell'onda elettromagnetica |
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nel secondo mezzo è necessario fare ricorso alle equazioni di |
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@ -675,7 +700,7 @@ delle componenti normali e trasverse del campo elettrico attraverso |
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l'interfaccia tra due materiali diversi. |
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Un'onda elettromagnetica monocromatica piana con vettore d'onda |
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$\vec{k}$ sarà descritta dal campo elettrico |
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$\vec{k}$ e frequenza angolare $\omega$ sarà descritta dal campo elettrico |
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\begin{equation} |
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\label{eq:e_field} |
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\vec{E}(\vec{r},t) = |
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@ -689,13 +714,13 @@ $\vec{k}$ sarà descritta dal campo elettrico |
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La direzione del vettore $k$ corrisponde a quella di propagazione |
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dell'onda elettromagnetica e il suo modulo, il \emph{numero |
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d'onda}, dipende dall'indice di rifrazione del mezzo attraversato |
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e dalla frequenza della radiazione: |
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e dalle frequenze della radiazione: |
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\begin{equation} |
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\label{eq:k_vinc} |
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k = \frac{\omega}{c / n} |
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\Rightarrow |
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(\vec{k})_x^2 + (\vec{k})_y^2 + (\vec{k})_z^2 |
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|
k^2 = (\vec{k})_x^2 + (\vec{k})_y^2 + (\vec{k})_z^2 |
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= \frac{n^2 \omega^2}{c^2} |
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|
\end{equation} |
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@ -707,7 +732,7 @@ $\theta_i$. |
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Possiamo descrivere la propagazione attraverso la superficie di |
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separazione usando un sistema di riferimento dove l'asse $z$ è |
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parallelo a essa e il vettore d'onda appartiene al piano $xz$. |
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Avremo quindi $(\vec{k})_y = 0$ e $k^2 =(\vec{k})_x^2 + (\vec{k})_z^2)$. |
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\begin{figure}[ht] |
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|
\centering |
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|
\includegraphics[width=\linewidth]{images/ev_wave.pdf} |
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|
@ -786,25 +811,26 @@ sostituendo $\vec{k_t}$ nell'espressione \ref{eq:e_field}: |
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e^{-\alpha x} |
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\end{equation} |
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L'ampiezza del campo elettrico trasmesso decade quindi |
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Il modulo del campo elettrico trasmesso decade quindi |
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esponenzialmente all'aumentare della distanza dalla superficie di |
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separazione. |
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Possiamo definire la profondità di penetrazione $d_p$ come il valore |
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di $x$ per il quale l'ampiezza del campo elettrico è scesa a $1/e$ |
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del valore iniziale: |
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di $x$ per il quale l'intensità luminosa si è ridotta di un fattore $1/e$ |
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rispetto al valore iniziale: |
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\begin{equation} |
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\label{eq:depth} |
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d_p |
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= \frac{1}{\alpha} |
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= \frac{c}{n_1 \omega} \frac{1}{\sqrt{ |
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|
= \frac{1}{2\alpha} |
|
|
|
= \frac{c}{2 n_1 \omega} \frac{1}{\sqrt{ |
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|
\sin^2\theta_i - \sin^2\theta_c |
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|
}} |
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= \frac{\lambda_0}{2 \pi n_1} \frac{1}{\sqrt{ |
|
|
|
= \frac{\lambda_0}{4 \pi n_1} \frac{1}{\sqrt{ |
|
|
|
\sin^2\theta_i - \sin^2\theta_c |
|
|
|
}} |
|
|
|
\end{equation} |
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Questo valore è importante per capire qual è la profondità massima |
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di un fluoroforo affinché questo possa scambiare energia con |
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|
di un fluoroforo affinché questo possa scambiare energia con |
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l'onda evanescente ed emettere fluorescenza. |
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Se consideriamo gli indici di rifrazione tipici del vetrino |
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coprioggetti ($n_1 \approx 1.5$) e di una soluzione acquosa |
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@ -812,14 +838,25 @@ coprioggetti ($n_1 \approx 1.5$) e di una soluzione acquosa |
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\SI{60}{\degree}$. |
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Considerando una lunghezza d'onda di eccitazione tipicamente usata |
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in microscopia di fluorescenza, $\lambda_0 = \SI{532}{\nm}$, e |
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un angolo di incidenza $\theta_c \approx \SI{62}{\degree}$, |
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otteniamo una profondità di penetrazione $d_p$ di circa \SI{300}{\nm}. |
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un angolo di incidenza $\theta_i \approx \SI{62}{\degree}$, |
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otteniamo una profondità di penetrazione $d_p$ di circa \SI{150}{\nm}. |
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Questi numeri ci danno un'idea del limiti del campo |
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di applicazione della microscopia TIRF. Quando è necessario |
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individuare fluorofori che si trovano a una profondità maggiore |
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di poche centinaia di nanometri rispetto al vetrino coprioggetti |
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questa tecnica non è più utilizzabile. |
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questa tecnica non è più utilizzabile. Inoltre, come recentemente |
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evidenziato \cite{}, esistono limiti che mettono in discussione |
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l'applicabilità dell'equazione \ref{eq:depth} in situazioni reali; |
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questa infatti non tiene conto di alcuni fattori, come la |
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- seppur piccola - divergenza del fascio laser gaussiano, che non |
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consente di definire univocamente l'angolo di incidenza. |
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Le caratteristiche del sistema ottico e variazioni di indice di |
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rifrazione all'interno del campione possono, in generale, fare sì |
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che una considerevole parte di radiazione diretta (non evanescente) |
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attraversi il campione. In generale non è possibile conoscere con |
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certezza il volume illuminato a priori, ma è necessario eseguire |
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un qualche tipo di calibrazione. |
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Per ottimizzare il rapporto segnale/rumore quando si deve lavorare |
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a profondità maggiori è stata sviluppata un'altra tecnica, la HILO, |
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@ -836,10 +873,11 @@ ridotto del campione. |
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In questo caso, come mostrato in figura \ref{fig:hilo}, si sfrutta |
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un fascio di illuminazione obliquo rispetto alla superficie del |
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campione. Questo fascio obliquo interseca sempre il centro del |
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sistema ottico, e quindi del cammino di raccolta della fluorescenza, |
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sistema ottico, e quindi la parte del campione a fuoco (ovvero posta |
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in un piano coniugato del sensore CMOS o CCD), |
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ma eccitando esclusivamente i fluorofori in uno spessore ridotto |
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del campione ($d$), ad una quota sulla superficie dipendente dallo |
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spostamento orizzontale del fascio di eccitazione ($\Delta x$). |
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del campione ($d$), attorno al piano focale, a una quota sulla superficie |
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dipendente dallo spostamento orizzontale del fascio di eccitazione ($\Delta x$). |
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\begin{figure}[ht] |
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|
\centering |
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@ -852,7 +890,8 @@ spostamento orizzontale del fascio di eccitazione ($\Delta x$). |
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|
\end{figure} |
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Lo spessore verticale illuminato è tanto più piccolo quanto |
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maggiore è l'angolo di incidenza del fascio. |
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maggiore è l'angolo di incidenza del fascio e tanto minore è |
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il diametro del fascio D (e quindi il campo visivo illuminato). |
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Nel caso dell'ottica geometrica lo spessore $d$ è dato dalla |
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relazione: |
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@ -860,12 +899,15 @@ relazione: |
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d = \frac{D}{\tan\theta_t} |
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\end{equation} |
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Quindi potrebbe essere reso piccolo a piacere avvicinando l'angolo |
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dove D è il diametro del fascio sul piano di incidenza e $\theta_t$ è l'angolo |
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del fascio rifratto rispetto alla normale. |
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Lo spessore $d$, quindi, potrebbe essere reso piccolo a piacere avvicinando l'angolo |
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di incidenza all'angolo critico. Tuttavia i fasci luminosi utilizzati, |
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tipicamente generati da un \textit{laser}, sono di tipo gaussiano e |
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non si propagano secondo le leggi dell'ottica geometrica. |
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In particolare il raggio minimo del fascio (\textit{waist}) e |
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la sua divergenza sono inversamente correlati. Se $w_0$ è il minimo |
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la sua divergenza sono inversamente correlati. Se $\$w_0$ è il minimo |
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valore del raggio del fascio durante la sua propagazione e $z$ è |
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la distanza, lungo la direzione di propagazione, dal punto di minimo, |
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l'evoluzione del raggio di un fascio gaussiano seguirà l'andamento: |
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@ -880,16 +922,37 @@ l'evoluzione del raggio di un fascio gaussiano seguirà l'andamento: |
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\right)^2} |
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\end{equation} |
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Il parametro $z_R$ introdotto nell'equazione \ref{eq:waist} rappresenta |
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una proprietà importante dei fasci gaussiani, ovvero il \textit{parametro |
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confocale}. A una distanza $z_R$ dal \textit{waist} lungo la direzione |
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di propagazione il diametro del fascio risulta aumentato di un fattore |
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$\sqrt{2}$, per poi continuare a crescere secondo la relazione \ref{eq:waist}. |
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Quindi, maggiore è la lunghezza $z_R$ minore sarà la divergenza. Questa lunghezza, |
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però, è inversamente proporzionale al diametro minimo del fascio, come si può |
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vedere confrontando il secondo e il terzo membro dell'equazione \ref{eq:waist}. |
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Questo vuol dire che è possibile ottenere un fascio gaussiano con un diametro più |
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piccolo solo aumentandone la divergenza. |
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%%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% |
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Le dimensioni del \textit{waist} nella direzione perpendicolare alla |
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Nel caso della diffrazione di un fascio gaussiano, passando da un mezzo |
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con indice di rifrazione $\theta_i$ a uno con indice di rifrazione $\theta_r$, |
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|
le dimensioni del \textit{waist} nella direzione perpendicolare alla |
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superficie d'incidenza vengono compresse di un fattore |
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$\cos\theta_i / \cos\theta_r$, ma manterrà questo spessore |
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solo entro una lunghezza trasversale confrontabile con |
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$z_R' = \pi (w_0 \cos\theta_i / \cos\theta_r)^2 / \lambda$, |
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prima di divergere secondo l'equazione \ref{eq:waist}. |
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$\cos\theta_i / \cos\theta_r$. La divergenza del fascio sarà però determinata |
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dal nuovo fattore confocale |
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$z_R' = \pi (w_0')^2 / \lambda = \pi (w_0 \cos\theta_i / \cos\theta_r)^2 / \lambda$ |
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(vedi figura \ref{fig:gaussian_hilo}). |
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\begin{figure}[ht] |
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\centering |
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\includegraphics[width=0.5\linewidth]{gaussian_hilo.pdf} |
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\caption{Compressione di un fascio gaussiano in seguito a rifrazione.} |
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\label{fig:gaussian_hilo} |
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\end{figure} |
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Possiamo quindi affermare che viene effettivamente illuminato uno |
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spessore di campione $\delta x = 2 w_0 \cos\theta_i / \cos\theta_r$ |
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spessore di campione $\delta x = 2 w_0' = 2 w_0 \cos\theta_i / \cos\theta_r$ |
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attraverso una lunghezza trasversale |
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$\delta z = 2 z_R' = |
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2 \pi (w_0 \cos\theta_i / \cos\theta_r)^2 / \lambda$ |
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@ -901,7 +964,11 @@ modificato allontanando o avvicinando il campione |
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dall'obiettivo, la posizione in cui il fascio inclinato incide |
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sul vetrino risulterà traslata orizzontalmente e, di conseguenza, il |
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fascio di illuminazione attraverserà il centro del campione in |
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corrispondenza del piano focale. |
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corrispondenza del piano focale, come mostrato in figura \ref{fig:hilo_focus} |
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\begin{figure}[ht] |
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|
|
\centering |
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|
|
\includegraphics[width=0.5\linewidth]{hilo_focus.pdf} |
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|
|
\caption{Illuminazione HILO e selezione del piano focale.} |
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|
\label{fig:hilo_focus.pdf} |
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|
|
\end{figure} |
Lorenzo Zolfanelli
4 years ago
