incluse correzioni Capitans CAP 1

chapters/1-introduction.tex

@@ -8,8 +8,8 @@ ruolo importante nel determinare il corretto funzionamento di cellule,
 tessuti e organismi complessi.
 
 Mentre tradizionalmente la biologia si è occupata di studiare come
-processi cellulari e intercellulari fossero regolati dallo scambio
-di molecole biologiche, il ruolo degli stimoli meccanici è stato a
+processi cellulari e intercellulari fossero regolati dalle reazioni
+biochimiche e dalla genetica, il ruolo degli stimoli meccanici è stato a
 lungo ritenuto marginale nella descrizione di questi processi.
 
 Lo sviluppo di tecniche sempre più avanzate e precise per la
@@ -95,15 +95,15 @@ Infatti, fino a ora il principale limite di questi esperimenti è
 stato quello di produrre informazioni dinamiche
 esclusivamente sui due componenti interagenti selezionati per la
 spettroscopia di forza, trascurando ogni altra possibile interazione.
-Se in diversi scenari questo è più che sufficiente, alcuni
+Se in diversi scenari questo è più che sufficiente, in alcuni
 sistemi biologici, questo approccio mostra evidenti limiti nello
-studio di una complessa rete di interazioni come quella delle
+studio di una complessa rete di interazioni, come quella delle
 giunzioni cellulari.
 
 Un apparato con queste caratteristiche dovrebbe consentire,
 durante un esperimento di spettroscopia di forza, di registrare
 simultaneamente sia la risposta meccanica delle due proteine
-immobilizzare, sia l'eventuale interazione con altri fattori
+immobilizzate, sia l'eventuale interazione con altri fattori
 opportunamente marcati presenti nella soluzione usata per
 l'esperimento.
 
@@ -125,18 +125,18 @@ Questi schemi di illuminazione però richiedono requisiti molto
 stringenti.
 Ad esempio per poter utilizzare la TIRF, come approfondito in sezione
 \ref{sec:fluo} è necessario che il volume osservato sia nelle
-immediate vicinanze della superficie del vetrino
+immediate vicinanze (poche centinaia di nanometri) della superficie del vetrino
 coprioggetti usato per la preparazione del campione,
 condizione che è impossibile realizzare negli esperimenti di
 spettroscopia di forza, dove le proteine vengono funzionalizzate su
-sfere dielettriche di dimensioni micrometriche.
+sfere di silice di dimensioni micrometriche.
 In questo caso infatti il volume di campione
-dove si trovano le proteine interagenti ha uno quota significativa
-(diverse centinaia di micrometri) rispetto al vetrino coprioggetti.
+dove si trovano le proteine interagenti è posto a una quota significativa
+rispetto alla zona illuminata nelle vicinanze del vetrino coprioggetti.
 
 Scopo dell'apparato sperimentale sarà anche studiare la possibilità di
 superare questo limite usando la sfera dielettrica come risuonatore
-ottico, e quindi come strumento in grado di trasferire la radiazione
+o foceggiatore ottico, e quindi come strumento in grado di trasferire la radiazione
 di eccitazione dall'immediata prossimità del vetrino coprioggetti ai
 fluorofori presenti in prossimità del sito di interazione.
 In questo modo il segnale proveniente da molecole fuori fuoco,
@@ -233,12 +233,12 @@ con il citoscheletro. É stato scoperto
 \emph{vinculina} e \emph{$\alpha$-actinina} svolgono questa attività.
 
 Sebbene la funzione di questi collegamenti indiretti non sia stata
-ancora del tutto compresa, è stato dimostrato che la sua presenza
-delle proteine responsabili è fondamentale per il corretto sviluppo
+ancora del tutto compresa, è stato dimostrato che la presenza
+delle proteine responsabili di tali collegamenti è fondamentale per il corretto sviluppo
 dei tessuti.
-Esperimenti su colture cellulari in il gene che codifica l'espressione
+Esperimenti su colture cellulari in cui il gene che codifica l'espressione
 della vinculina è stato rimosso suggeriscono come, oltre ad una
-riduzione generale dell'adesione tra cellule, si perda alcune funzioni
+riduzione generale dell'adesione tra cellule, si perdano alcune funzioni
 di regolazione
 e modulazione dell'attività delle giunzioni.
 
@@ -287,7 +287,7 @@ tra un certo numero di proteine interagenti.
 Diverse proteine attraversano la membrana e dimerizzano con le loro
 omologhe appartenenti alla cellula adiacente, tra le quali
 \emph{claudina}, \emph{occludina} e diverse proteine appartenenti
-alla classe delle \textit{junctional adhesion molecules}, (JAM).
+alla classe delle \textit{junctional adhesion molecules} (JAM).
 Queste proteine di membrana si legano alla proteina \textit{Zona
 occludens 1}, ZO-1 che, come mostrato da recenti studi
 \cite{Vasileva2020},
@@ -297,7 +297,7 @@ Inoltre vi sono evidenze sul ruolo di una terza proteina, la
 \textit{cingulina}, nel modulare l'interazione di ZO-1 con il
 citoscheletro di actina. Un'ipotesi è che il legame cingulina-ZO-1
 possa indurre delle modifiche conformazionali in ZO-1 tali da
-consentire un legame diretto con in filamenti di actina.
+consentire un legame diretto con i filamenti di actina.
 Anche in questo caso, per comprendere il ruolo della cingulina nella
 trasduzione dei segnali meccanici, sembra promettente utilizzare una
 tecnica che consenta, durante l'osservazione dell'interazione di due
@@ -338,8 +338,8 @@ applicazioni ai sistemi biologici''}.
 Grazie alle pinzette ottiche è possibile intrappolare solidi
 dielettrici di diversa dimensione e natura.
 Per ottenere la capacità di manipolare individualmente singole
-molecole, come le proteine non è possibile procedere ad un
-intrappolamento diretto.
+molecole, come le proteine in una soluzione acquosa a temperatura ambiente,
+non è possibile procedere ad un intrappolamento diretto.
 
 Si rende necessario quindi sviluppare protocolli per funzionalizzare
 la superficie di sfere dielettriche e legarci le molecole che
@@ -347,14 +347,14 @@ intendiamo studiare.
 
 Tipicamente esperimenti di questo tipo vengono realizzati utilizzando
 sfere dielettriche di dimensioni micrometriche funzionalizzate legando
-covalentemente molecole di \textit{streptavidina} alla loro
-superficie.
-
+covalentemente le proteine o le molecole biologiche di interesse.
+In alternativa, vengono legate sulla superficie delle microsfere molecole di
+\textit{streptavidina}.
 In questo modo è possibile successivamente ottenere il legame delle
-microsfere col polimero biologico d'interesse, purché esso sia stato
-preventivamente legato a molecole di biotina (biotilinato).
-Si sfrutta in questo modo il legame streptavidina-biotina, estremamente stabile e praticamente
-irreversibile (vedi figura \ref{fig:biotin-streptavidin}).
+microsfere col polimero biologico o la proteina d'interesse, purché essi siano stati
+preventivamente biotilinati.
+Si sfrutta in questo modo il legame streptavidina-biotina, estremamente stabile nei tempi
+tipici di un esperimento di singola molecola (vedi figura \ref{fig:biotin-streptavidin}).
 
 \begin{figure}[ht]
     \centering
@@ -377,11 +377,11 @@ col campo elettromagnetico può essere scomposta in due contributi:
     \item La \textbf{forza di \textit{scattering}} o pressione di
         radiazione, sempre orientata nella direzione di propagazione
         della radiazione e proporzionale alla sua intesità.
-    \item La \textbf{forza di dipolo} o gradiente, proporzionale
-        al gradiente d'intensità della radiazione elettromagnetico.
+    \item La \textbf{forza di gradiente}, proporzionale
+        al gradiente d'intensità della radiazione elettromagnetica.
 \end{itemize}
 
-L'origine di questi due contributi e la dipenza dalle caratteristiche
+L'origine di questi due contributi e la dipendenza dalle caratteristiche
 della microsfera e del liquido utilizzati possono essere derivate
 analiticamente dalle equazioni di Maxwell nei limiti del regime
 di Rayleigh, ovvero quando le dimensioni della sfera sono molto
@@ -390,23 +390,30 @@ inferiori alla lunghezza d'onda della radiazione utilizzata.
 In questo limite possiamo considerare il materiale interagente con la
 radiazione come un dipolo elettrico puntiforme, associato ad una
 polarizzabilità $\alpha$. Il vettore di polarizzazione nel dipolo
-puntiforme sarà quindi $\vec{p} = \alpha \vec{E}$.
+puntiforme sarà quindi $\vec{p} = \alpha \vec{E}$, dove il vettore $\vec{E}$
+è il campo elettrico che induce la polarizzazione.
 
 La pressione di radiazione sarà quindi proporzionale all'impulso
 dei fotoni retrodiffusi per \textit{scattering} Rayleigh.
 Nel caso di una microsfera di raggio $a$, indice di rifrazione $n$,
-immersa in un fluido con indice di rifrazione $m$, la forza di
+investita da un'onda piana di intensità $I_0$, vettore d'onda $\vec{k}$
+e immersa in un fluido con indice di rifrazione $m$, la forza di
 \textit{scattering} può essere espressa\cite{HARADA1996529} come:
 
 \begin{equation}
-\vec{F}_r = \hat{k} \frac{8 \pi n k^4 a^6}{3c}
+\vec{F}_r = \hat{k} I_0  \frac{8 \pi n k^4 a^6}{3c}
 \left(
 \frac{(n/m)^2 - 1}{(n/m)^2 + 2}
 \right)^2
 \end{equation}
 
-L'espressione della forza gradiente può essere ottenuta
-dall'interazione lorentziana tra la radiazione e il dipolo puntiforme:
+Dove $c$ è la velocità della luce nel vuoto.
+
+L'espressione della forza di gradiente può essere ottenuta
+dall'interazione lorentziana tra la radiazione e il dipolo puntiforme.
+
+Infatti, se $\vec{p}$ è il vettore di polarizzazione e $\vec{E}, \vec{B}$ sono
+i vettori dei campi elettrici e magnetici della radiazione, abbiamo:
 
 $$ \vec{F}_g =
     \left(
@@ -427,35 +434,32 @@ $$ \vec{F}_g =
 $$
 
 E infine, tenendo conto delle \emph{equazioni di Maxwell} e
-dell'algebra dei vettori:
+dell'algebra dei vettori, e mediando su un periodo di oscillazione, otteniamo:
 
 \begin{equation}
 \label{dipole_force}
 \vec{F_g} =
-    \alpha 
+    \alpha
     \left[
         \frac{1}{2}\nabla E^2
-        + \frac{d}{dt}\left(\vec{E} \times \vec{B}\right)
     \right]
 \end{equation}
 
-Questa ultima forma (equazione \ref{dipole_force}) ci permette di
-mettere in evidenza il termine $\frac{d}{dt}(\vec{E} \times \vec{B})$,
-ovvero la derivata temporale di una quantità oscillante molto
+Il termine dipendente dal campo magnetico è la derivata di una quantità che cambia
 rapidamente (\SI{> 1e14}{\Hz}), che
-può tranquillamente essere considerata costante se confrontata con in
-tempi tipici dell'evoluzione meccanica del sistema.
-Il secondo termine può quindi essere trascurato e, sostituendo ad
+può tranquillamente essere considerata nulla se confrontata con in
+tempi tipici dell'evoluzione meccanica del sistema, e può quindi essere trascurato.
+Sostituendo ad
 $\alpha$ l'espressione per la polarizzabilità della microsfera
 otteniamo:
 
 \begin{equation}
-\vec{F}_g = 
-    \frac{2\pi n a^3}{c}
+\vec{F}_g =
+    \frac{2\pi a^3}{c}
     \left(
         \frac{(n/m)^2 - 1}{(n/m)^2 + 2}
     \right)
-    \nabla I(\vec{r})
+    \nabla I_0(\vec{r})
 \end{equation}
 
 Il risultato netto dei due contributi è che la microsfera tenderà ad
@@ -468,7 +472,7 @@ dell'ottica geometrica, quando la particella è al contrario di
 dimensioni molto maggiori alla lunghezza d'onda intermedia.
 
 Il caso intermedio richiede l'uso della più complessa teoria
-Lorenz-Mie e spesso il ricorso a soluzioni numeriche, ma l'idea
+Lorenz-Mie e il ricorso a soluzioni numeriche, ma l'idea
 qualitativa alla base dell'intrappolamento resta valida.
 
 Nel caso generale i requisiti per un intrappolamento efficace sono
@@ -476,13 +480,24 @@ quelli di avere una forza di gradiente maggiore di quella di
 scattering e una energia cinetica delle particelle intrappolate
 sufficientemente bassa (quindi un fluido sufficientemente viscoso).
 
-Per le nostre applicazioni è sufficiente considerare una forza di
-richiamo del tipo 
+Per le nostre applicazioni è sufficiente considerare, su un piano
+perpendicolare alla dirazione di propagazione del fascio, una forza di
+richiamo del tipo:
 
 \begin{equation}
-    \vec{F} = -k(\vec{x}-\vec{x}_{eq})
+    \vec{F}_\perp = -k_{\perp}(\vec{x}_{\perp}-\vec{x}_{\perp,eq})
 \end{equation}
 
+Dove $\vec{x}_{\perp}$ è la proiezione della posizione della particella
+intrappolata sul piano considerato, $\vec{x}_{\perp.eq}$ è la posizione di equilibrio,
+corrispondente al centro della fascio in assenza di forze esterne, e $k_{\perp}$ è
+la costante elastica relativa alla forza di richiamo sul piano perpendicolare.
+
+Lungo la direzione assiale la particella sarà analogamente confinata ma con un costante
+elastica minore e variabile con la posizione. In particolare il suo valore non sarà
+simmetrico rispetto al fuoco del fascio quando si considera il contributo aggiuntivo
+della forza di scattering.
+
 \begin{figure}[ht]
     \centering
     \includegraphics[scale=.4]{images/fkx.pdf}
@@ -504,8 +519,10 @@ seguenti effetti:
         equilibrio (moto browniano).
 \end{itemize}
 
-Grazie alla termodinamica statistica è possibile mettere in relazione
-lo spettro delle fluttuazioni di posizione di una sfera intrappolata
+Riuscendo a misurare le fluttuazioni della posizione della sfera intrappolata,
+con un sistema come quello descritto in sezione \ref{sec:tweezer}, è possibile
+sfruttare la termodinamica statistica per mettere in relazione
+lo spettro di queste
 con il parametro $k$ della forza elastica di richiamo
 (vedi sezione \ref{sec:calibration}).
 In questo modo, una volta determinato $k$, è possibile mettere
@@ -513,25 +530,30 @@ in relazione il valore delle forze esterne agenti sulla sfera con il
 suo spostamento dalla posizione di riposo.
 
 
+
 \section{Microscopia di fluorescenza di singola molecola}
 \label{sec:fluo}
 
 % come evitare ripetizione "singola(e) molecola(e)"
-Tipicamente, le tecniche di microscopia di fluorescenza di singola
-molecola consentono di sondare la posizione e i movimenti di singole
-molecole con risoluzioni spaziali e temporali prossime,
-rispettivamente, al nanometro e al millisecondo.
-
-In ambito biologico le molecole che vengono osservate con questa
-tecniche sono polimeri di varia natura, come proteine e acidi
+Le tecniche di microscopia di fluorescenza di singola molecola consentono
+di sondare la posizione e i movimenti di singole molecole con risoluzioni
+spaziali e temporali che dipendono dalla tipologia di cromofori utilizzati.
+Tipicamente, usando cromofori standard, si riesce ad arrivare a risoluzioni
+spaziali di decine di nanometri con un tempo di integrazione di circa \SI{10}{\ms}.
+Per avvicinarsi a una risoluzione spaziale di \SI{1}{\nm} è necessario aumentare
+il tempo di integrazione fino ad almeno \SI{1}{\s}.
+
+In ambito biologico le molecole che vengono osservate con queste
+tecniche sono di varia natura, ad esempio proteine o acidi
 nucleici. Anche se alcune di queste molecole possono avere una
 debole fluorescenza intrinseca, si fa quasi sempre ricorso alla
 marcatura con fluorofori, cioè molecole con caratteristiche di
 fluorescenza note e elevata resa quantica. In questo modo è
-possibile ottenere livelli di segnale maggiori e soprattutto 
+possibile ottenere livelli di segnale maggiori e soprattutto
 un'elevata specificità nel rendere rilevabili solo le molecole
 che presentano caratteristiche di interesse.
-Queste due proprietà sono, come vedremo, molto importanti per
+Queste due proprietà sono, come vedremo, molto importanti per riuscire
+a rivelare singole molecole biologiche e per
 raggiungere una buona precisione di localizzazione.
 
 Le tecniche di microscopia di fluorescenza sono molto flessibili
@@ -569,15 +591,15 @@ standardizzati. La scelta del fluoroforo e del protocollo di marcatura
 devono tener conto di numerosi fattori, tra i quali: le condizioni
 dell'esperimento (in vivo o in vitro), le possibili interferenze col
 comportamento del sistema studiato, la compatibilità con le sostanze
-chimiche usate in soluzione, la stabilità del fluoroforo stesso e il 
+chimiche usate in soluzione, la stabilità del fluoroforo stesso e il
 suo tempo di vita.
 
 Per la produzione delle immagini esistono due macro-categorie di
 tecniche: le microscopie a campo largo (o \textit{wide-field}) e
-le miscroscopie a scansione puntiforme.
+le microscopie a scansione puntiforme.
 Nel primo caso l'intero volume osservato viene illuminato
 uniformemente e la radiazione emessa per fluorescenza viene raccolta
-e ingrandita da un opportuno cammino ottico che ricostruisce
+e ingrandita da un opportuno sistema ottico che ricostruisce
 l'immagine sulla matrice di un sensore CMOS o CCD.
 Nel secondo caso l'area di interesse viene suddivisa in un reticolo
 tridimensionale di punti e ogni punto viene acquisito sequenzialmente,
@@ -587,7 +609,7 @@ unico punto, coincidente con l'apertura di un fotodiodo o di un
 fotomoltiplicatore.
 
 Il principale vantaggio delle tecniche a scansione rispetto a quelle
-a campo largo risiede in una più marcata soppressione del
+a campo largo risiede, solitamente, in una più marcata soppressione del
 rumore di fondo dovuto all'emissione di fluorescenza fuori dal
 piano focale. I microscopi che sfruttano queste tecniche sono infatti
 equipaggiati di opportuni accorgimenti per filtrare sia la radiazione
@@ -608,11 +630,11 @@ decresce all'aumentare delle dimensioni dell'area osservata e della
 densità di punti acquisita.
 
 La microscopia a campo largo, acquisendo simultaneamente tutto il
-fotogramma in una sola volta, consente di raggiungere risoluzioni
+campo visivo in una sola volta, consente di raggiungere risoluzioni
 temporali molto elevate anche per campioni estesi. La velocità
 di acquisizione di un singolo fotogramma è essenzialmente limitata
-dalla sensibilità del sensore usato e dalla velocità della sua scheda
-elettronica.
+dalla sensibilità del sensore usato e dalla velocità di trasferimento
+dei dati.
 Tuttavia, in questo caso, sul sensore si va a sommare all'immagine
 proveniente dai fluorofori nel piano focale quella, fuori fuoco,
 di tutti gli emettitori che si trovano su piani diversi attraversati
@@ -628,11 +650,11 @@ manipolando il fascio di eccitazione, consentono di ridurre lo
 spessore del volume di campione eccitato, come la microscopia a
 riflessione interna totale
 (TIRF, \textit{Total Internal Reflection Fluorescence microscopy})
-o quella a fogli di luce inclinati
+o quella a foglio di luce inclinato
 (HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet
 microscopy}).
 Grazie a queste due tecniche è possibile ottenere una sensibilità
-di singola molecola a una risoluzione temporale nell'ordine dei
+di singola molecola con una risoluzione temporale nell'ordine dei
 millisecondi, rendendo possibile ad esempio il tracciamento
 degli spostamenti di una proteina.
 
@@ -647,7 +669,10 @@ campione.
 L'onda evanescente viene ottenuta facendo incidere il fascio
 di eccitazione all'interfaccia di separazione tra il vetrino
 coprioggetti e il campione con un angolo maggiore rispetto
-all'angolo critico $\theta_c$ definito dalla \emph{legge di Snell}:
+all'angolo critico $\theta_c$ definito dalla \emph{legge di Snell}.
+Un fascio che incide sulla superficie di separazione tra due mezzi con
+indice di rifrazione $n_i$ e $n_t$, con un angolo rispetto alla normale
+$\theta_i$, verrà rifratto a un angolo $\theta_r$ definito dalla relazione:
 
 \begin{multline}
     n_i \sin(\theta_i) = n_t \sin(\theta_t) \\
@@ -666,7 +691,7 @@ reale, si può avere \emph{riflessione interna totale} se l'angolo
 di incidenza è superiore a $\theta_c$.
 In queste condizioni tutta l'energia dell'onda incidente viene
 riflessa nel primo mezzo e non si ha la formazione di un raggio
-trasmesso nel secondo.
+rifratto nel secondo.
 
 Per studiare le caratteristiche dell'onda elettromagnetica
 nel secondo mezzo è necessario fare ricorso alle equazioni di
@@ -675,7 +700,7 @@ delle componenti normali e trasverse del campo elettrico attraverso
 l'interfaccia tra due materiali diversi.
 
 Un'onda elettromagnetica monocromatica piana con vettore d'onda
-$\vec{k}$ sarà descritta dal campo elettrico
+$\vec{k}$ e frequenza angolare $\omega$ sarà descritta dal campo elettrico
 \begin{equation}
 \label{eq:e_field}
     \vec{E}(\vec{r},t) = 
@@ -689,13 +714,13 @@ $\vec{k}$ sarà descritta dal campo elettrico
 La direzione del vettore $k$ corrisponde a quella di propagazione
 dell'onda elettromagnetica e il suo modulo, il \emph{numero
 d'onda}, dipende dall'indice di rifrazione del mezzo attraversato
-e dalla frequenza della radiazione:
+e dalle frequenze della radiazione:
 
 \begin{equation}
 \label{eq:k_vinc}
 k = \frac{\omega}{c / n}
     \Rightarrow
-(\vec{k})_x^2 + (\vec{k})_y^2 + (\vec{k})_z^2
+k^2 = (\vec{k})_x^2 + (\vec{k})_y^2 + (\vec{k})_z^2
     = \frac{n^2 \omega^2}{c^2}
 \end{equation}
 
@@ -707,7 +732,7 @@ $\theta_i$.
 Possiamo descrivere la propagazione attraverso la superficie di
 separazione usando un sistema di riferimento dove l'asse $z$ è
 parallelo a essa e il vettore d'onda appartiene al piano $xz$.
-
+Avremo quindi $(\vec{k})_y = 0$ e $k^2 =(\vec{k})_x^2 + (\vec{k})_z^2)$.
 \begin{figure}[ht]
     \centering
     \includegraphics[width=\linewidth]{images/ev_wave.pdf}
@@ -786,25 +811,26 @@ sostituendo $\vec{k_t}$ nell'espressione \ref{eq:e_field}:
         e^{-\alpha x}
 \end{equation}
 
-L'ampiezza del campo elettrico trasmesso decade quindi
+Il modulo del campo elettrico trasmesso decade quindi
 esponenzialmente all'aumentare della distanza dalla superficie di
 separazione.
 Possiamo definire la profondità di penetrazione $d_p$ come il valore
-di $x$ per il quale l'ampiezza del campo elettrico è scesa a $1/e$
-del valore iniziale:
+di $x$ per il quale l'intensità luminosa si è ridotta di un fattore $1/e$
+rispetto al valore iniziale:
 \begin{equation}
+\label{eq:depth}
 d_p
-    = \frac{1}{\alpha}
-    = \frac{c}{n_1 \omega} \frac{1}{\sqrt{
+    = \frac{1}{2\alpha}
+    = \frac{c}{2 n_1 \omega} \frac{1}{\sqrt{
         \sin^2\theta_i - \sin^2\theta_c
     }}
-    = \frac{\lambda_0}{2 \pi n_1} \frac{1}{\sqrt{
+    = \frac{\lambda_0}{4 \pi n_1} \frac{1}{\sqrt{
         \sin^2\theta_i - \sin^2\theta_c
     }}
 \end{equation}
 
 Questo valore è importante per capire qual è la profondità massima
-di un fluoroforo affinché questo possa scambiare energia con 
+di un fluoroforo affinché questo possa scambiare energia con
 l'onda evanescente ed emettere fluorescenza.
 Se consideriamo gli indici di rifrazione tipici del vetrino
 coprioggetti ($n_1 \approx 1.5$) e di una soluzione acquosa
@@ -812,14 +838,25 @@ coprioggetti ($n_1 \approx 1.5$) e di una soluzione acquosa
 \SI{60}{\degree}$.
 Considerando una lunghezza d'onda di eccitazione tipicamente usata
 in microscopia di fluorescenza, $\lambda_0 = \SI{532}{\nm}$, e
-un angolo di incidenza $\theta_c \approx \SI{62}{\degree}$,
-otteniamo una profondità di penetrazione $d_p$ di circa \SI{300}{\nm}.
+un angolo di incidenza $\theta_i \approx \SI{62}{\degree}$,
+otteniamo una profondità di penetrazione $d_p$ di circa \SI{150}{\nm}.
 
 Questi numeri ci danno un'idea del limiti del campo
 di applicazione della microscopia TIRF. Quando è necessario
 individuare fluorofori che si trovano a una profondità maggiore
 di poche centinaia di nanometri rispetto al vetrino coprioggetti
-questa tecnica non è più utilizzabile.
+questa tecnica non è più utilizzabile. Inoltre, come recentemente
+evidenziato \cite{}, esistono limiti che mettono in discussione
+l'applicabilità dell'equazione \ref{eq:depth} in situazioni reali;
+questa infatti non tiene conto di alcuni fattori, come la
+- seppur piccola - divergenza del fascio laser gaussiano, che non
+consente di definire univocamente l'angolo di incidenza.
+Le caratteristiche del sistema ottico e variazioni di indice di
+rifrazione all'interno del campione possono, in generale, fare sì
+che una considerevole parte di radiazione diretta (non evanescente)
+attraversi il campione. In generale non è possibile conoscere con
+certezza il volume illuminato a priori, ma è necessario eseguire
+un qualche tipo di calibrazione.
 
 Per ottimizzare il rapporto segnale/rumore quando si deve lavorare
 a profondità maggiori è stata sviluppata un'altra tecnica, la HILO,
@@ -836,10 +873,11 @@ ridotto del campione.
 In questo caso, come mostrato in figura \ref{fig:hilo}, si sfrutta
 un fascio di illuminazione obliquo rispetto alla superficie del
 campione. Questo fascio obliquo interseca sempre il centro del
-sistema ottico, e quindi del cammino di raccolta della fluorescenza,
+sistema ottico, e quindi la parte del campione a fuoco (ovvero posta
+in un piano coniugato del sensore CMOS o CCD),
 ma eccitando esclusivamente i fluorofori in uno spessore ridotto
-del campione ($d$), ad una quota sulla superficie dipendente dallo
-spostamento orizzontale del fascio di eccitazione ($\Delta x$).
+del campione ($d$), attorno al piano focale, a una quota sulla superficie
+dipendente dallo spostamento orizzontale del fascio di eccitazione ($\Delta x$).
 
 \begin{figure}[ht]
     \centering
@@ -852,7 +890,8 @@ spostamento orizzontale del fascio di eccitazione ($\Delta x$).
 \end{figure}
 
 Lo spessore verticale illuminato è tanto più piccolo quanto
-maggiore è l'angolo di incidenza del fascio.
+maggiore è l'angolo di incidenza del fascio e tanto minore è
+il diametro del fascio D (e quindi il campo visivo illuminato).
 Nel caso dell'ottica geometrica lo spessore $d$ è dato dalla
 relazione:
 
@@ -860,12 +899,15 @@ relazione:
     d = \frac{D}{\tan\theta_t}
 \end{equation}
 
-Quindi potrebbe essere reso piccolo a piacere avvicinando l'angolo
+dove D è il diametro del fascio sul piano di incidenza e $\theta_t$ è l'angolo
+del fascio rifratto rispetto alla normale.
+
+Lo spessore $d$, quindi, potrebbe essere reso piccolo a piacere avvicinando l'angolo
 di incidenza all'angolo critico. Tuttavia i fasci luminosi utilizzati,
 tipicamente generati da un \textit{laser}, sono di tipo gaussiano e
 non si propagano secondo le leggi dell'ottica geometrica.
 In particolare il raggio minimo del fascio (\textit{waist}) e
-la sua divergenza sono inversamente correlati. Se $w_0$ è il minimo
+la sua divergenza sono inversamente correlati. Se $\$w_0$ è il minimo
 valore del raggio del fascio durante la sua propagazione e $z$ è
 la distanza, lungo la direzione di propagazione, dal punto di minimo,
 l'evoluzione del raggio di un fascio gaussiano seguirà l'andamento:
@@ -880,16 +922,37 @@ l'evoluzione del raggio di un fascio gaussiano seguirà l'andamento:
     \right)^2}
 \end{equation}
 
+Il parametro $z_R$ introdotto nell'equazione \ref{eq:waist} rappresenta
+una proprietà importante dei fasci gaussiani, ovvero il \textit{parametro
+  confocale}. A una distanza $z_R$ dal \textit{waist} lungo la direzione
+di propagazione il diametro del fascio risulta aumentato di un fattore
+$\sqrt{2}$, per poi continuare a crescere secondo la relazione \ref{eq:waist}.
+
+Quindi, maggiore è la lunghezza $z_R$ minore sarà la divergenza. Questa lunghezza,
+però, è inversamente proporzionale al diametro minimo del fascio, come si può
+vedere confrontando il secondo e il terzo membro dell'equazione \ref{eq:waist}.
+Questo vuol dire che è possibile ottenere un fascio gaussiano con un diametro più
+piccolo solo aumentandone la divergenza.
+
 %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%%
-Le dimensioni del \textit{waist} nella direzione perpendicolare alla
+Nel caso della diffrazione di un fascio gaussiano, passando da un mezzo
+con indice di rifrazione $\theta_i$ a uno con indice di rifrazione $\theta_r$,
+le dimensioni del \textit{waist} nella direzione perpendicolare alla
 superficie d'incidenza vengono compresse di un fattore
-$\cos\theta_i / \cos\theta_r$, ma manterrà questo spessore
-solo entro una lunghezza trasversale confrontabile con
-$z_R' = \pi (w_0 \cos\theta_i / \cos\theta_r)^2 / \lambda$,
-prima di divergere secondo l'equazione \ref{eq:waist}.
+$\cos\theta_i / \cos\theta_r$. La divergenza del fascio sarà però determinata
+dal nuovo fattore confocale
+$z_R' = \pi (w_0')^2 / \lambda = \pi (w_0 \cos\theta_i / \cos\theta_r)^2 / \lambda$
+(vedi figura \ref{fig:gaussian_hilo}).
+
+\begin{figure}[ht]
+  \centering
+  \includegraphics[width=0.5\linewidth]{gaussian_hilo.pdf}
+  \caption{Compressione di un fascio gaussiano in seguito a rifrazione.}
+  \label{fig:gaussian_hilo}
+\end{figure}
 
 Possiamo quindi affermare che viene effettivamente illuminato uno
-spessore di campione $\delta x = 2 w_0 \cos\theta_i / \cos\theta_r$
+spessore di campione $\delta x = 2 w_0' = 2 w_0 \cos\theta_i / \cos\theta_r$
 attraverso una lunghezza trasversale
 $\delta z = 2 z_R' =
 2 \pi (w_0 \cos\theta_i / \cos\theta_r)^2 / \lambda$
@@ -901,7 +964,11 @@ modificato allontanando o avvicinando il campione
 dall'obiettivo, la posizione in cui il fascio inclinato incide
 sul vetrino risulterà traslata orizzontalmente e, di conseguenza, il
 fascio di illuminazione attraverserà il centro del campione in
-corrispondenza del piano focale.
-
-
+corrispondenza del piano focale, come mostrato in figura \ref{fig:hilo_focus}
 
+\begin{figure}[ht]
+  \centering
+  \includegraphics[width=0.5\linewidth]{hilo_focus.pdf}
+  \caption{Illuminazione HILO e selezione del piano focale.}
+  \label{fig:hilo_focus.pdf}
+\end{figure}

chapters/2-setup.tex

@@ -205,6 +205,7 @@ consente di eseguire una calibrazione assistita.
 
 
 \section{Pinzette ottiche}
+\label{sec:tweezer}
 
 Il fascio \textit{laser} collimato in uscita da una sorgente
 \ce{Nd}:\ce{YVO4} attraversa immediatamente una serie di due isolatori

chapters/3-methods.tex

@@ -250,16 +250,16 @@ Osservando l'equazione di moto \ref{eq:bead_motion} si può
 descrivere la dinamica della sfera in due regimi estremi:
 \begin{itemize}
     \item il regime \textit{balistico}, quando il moto è dominato dalla componente inerziale, con un tempo caratteristico
-    di rilassamento $\tau_\text{bal} = m / \gamma$.
+    di rilassamento $\tau_{\textrm{bal}} = m / \gamma$.
     \item il regime \textit{diffusivo}, qunado il termine inerziale
     legato alla massa è trascurabile, con un tempo di rilasamento
-    $\tau_\text{diff} = \gamma / k$.
+    $\tau_{\textrm{diff}} = \gamma / k$.
 \end{itemize}
 
 Tenendo conto delle caratteristiche delle microsfere
-si hanno  valori $\tau_\text{bal} < \SI{1}{\us}$, mentre
+si hanno  valori $\tau_{\textrm{bal}} < \SI{1}{\us}$, mentre
 per i valori di $k$ ottenibili con il nostro sistema di pinzette
-ottiche è possibile ridurre $\tau_\text{diff}$ fino a circa
+ottiche è possibile ridurre $\tau_{\textrm{diff}}$ fino a circa
 \SI{100}{\us}.
 
 Il tempo di risposta del sistema nel regime balistico è quindi 
@@ -343,8 +343,8 @@ i valori di $\beta$ e $k$ imponendo i valori noti riportati in tabella \ref{tab:
      Distanza sfera da superificie & $d$ & \SI{1}{\um} \\
      Viscosità & $\eta$ & \SI{1e-3}{\Pa\second} \\
      Coefficiente attrito idrodinamico & $\gamma$ & $6 \pi \eta R \left(1+\frac{9R}{16d}\right)$\\
-     Frequenza minima & $\nu_\text{min}$ & \SI{15}{\Hz} \\
-     Frequenza massima & $\nu_\text{max}$ & \SI{50}{\kHz} \\
+     Frequenza minima & $\nu_{\textrm{min}}$ & \SI{15}{\Hz} \\
+     Frequenza massima & $\nu_{\textrm{max}}$ & \SI{50}{\kHz} \\
     \bottomrule
     \end{tabular}
     \caption{Parametri $fit$ distribuzione spettrale}
@@ -743,4 +743,4 @@ loro fluttuazioni e quindi influenzando la corretta esecuzione del \textit{force
 \caption{Ipotesi di esperimenti con fluorescenza di singola molecola combinata a \textit{force-clamp} e schema di illuminazione
 TIRF (a) e HILO (b).}
 \label{fig:three_beads}
-\end{figure}
+\end{figure}