@ -106,14 +106,15 @@ attraversato.
La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico
può essere modificata attraverso due traslatori controllati può essere modificata attraverso due traslatori controllati
elettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, ??)
elettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente,
P-527)
per spostamenti veloci e con risoluzione nanometrica, con una corsa di per spostamenti veloci e con risoluzione nanometrica, con una corsa di
\SI { 100} { \um } per asse, e uno di tipo motore passo-passo\SI { 100} { \um } per asse, e uno di tipo motore passo-passo
(Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI { 50} { \mm } per asse. (Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI { 50} { \mm } per asse.
Il piano focale può essere modificato variando la posizione Il piano focale può essere modificato variando la posizione
dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico
(Physik Instrumente, PIFOC™ ?? ) con con una corsa di \SI { 400} { \um }
(Physik Instrumente, PIFOC™ P-725 ) con con una corsa di \SI { 400} { \um }
e risoluzione nanometrica. Il microscopio è stato progettato in modo e risoluzione nanometrica. Il microscopio è stato progettato in modo
che al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenza che al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenza
della superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campione della superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campione
@ -121,7 +122,7 @@ preparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti).
I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivo I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivo
sono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente sono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente
?? e ?? ) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in
E-517 e E-665 ) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in
modalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungo modalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungo
raggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito da raggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito da
Galil Motion Control e equipaggiati di un \textit { encoder} che Galil Motion Control e equipaggiati di un \textit { encoder} che
@ -242,8 +243,8 @@ figura \ref{fig:aom}).
\label { fig:aom} \label { fig:aom}
\end { figure} \end { figure}
Una coppia di lenti piano-convesse con distanze focali di
\SIlist { ??;??} { \mm } incrementa la dimensione del fascio
Una coppia di lenti piano-convesse incrementa la dimensione del fascio
e rende il
piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il piano piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il piano
delle uscite degli AOM. In questo modo, per qualsiasi deflessione delle uscite degli AOM. In questo modo, per qualsiasi deflessione
angolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappole angolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappole
@ -371,7 +372,7 @@ tramite tre collimatori con specifiche diverse.
\centering \centering
\begin { tabular} { c c c c} \begin { tabular} { c c c c}
\toprule \toprule
$ \lambda [ \si { \nm } ] $ & f [\si { \mm } ] & $ ( \textrm { BD } ) _ { 1 / e ^ 2 } ~ [ \si { \mm } ] & M $ \\
$ \lambda [ \si { \nm } ] $ & f [\si { \mm } ] & $ ( \textrm { BD } ) _ { 1 / e ^ 2 } ~ [ \si { \mm } ] $ & M\\
\midrule \midrule
488 & 4 & 0.49 & 3.33x\\ 488 & 4 & 0.49 & 3.33x\\
532 & 11 & 1.57 & \\ 532 & 11 & 1.57 & \\
@ -380,39 +381,75 @@ tramite tre collimatori con specifiche diverse.
\end { tabular} \end { tabular}
\caption { Collimatori usati per estrarre i fasci alle varie \caption { Collimatori usati per estrarre i fasci alle varie
lunghezzed d'onda, con distanza focale indicata dal costruttore lunghezzed d'onda, con distanza focale indicata dal costruttore
(f) e diametro del fascio (BD) misuratomediante fit gaussiano.}
(f) e diametro del fascio (BD) misurato mediante fit gaussiano del
suo profilo d'intensità.}
\label { tab:my_ label} \label { tab:my_ label}
\end { table} \end { table}
I fasci a \SIlist { 488;635} { \nm } vengono ingranditi mediante I fasci a \SIlist { 488;635} { \nm } vengono ingranditi mediante
due telescopi realizzati con lenti piano-convesse. due telescopi realizzati con lenti piano-convesse.
L'emissione dei laser a diodo deve essere filtrata attraverso
filtri passa-banda stretti per evitare che radiazione a lunghezze
d'onda spurie diffonda nel campione e contamini l'emissione di
fluroescenza.
I tre fasci laser vengono combinati in un unico percorso ottico e
ingranditi di un fattore 10x per mezzo di un ulteriore telescopio
sul percorso comune, raggiungendo un diametro $ \approx \SI { 2 } { \cm } $ .
I fasci combinati sono focalizzati sul piano focale posteriore
dell'obiettivo da una lente con $ f = \SI { 500 } { \mm } $ , ottenendo
un fattore di scala di circa $ 1 / 150 $ e quindi un diametro
$ ( \textrm { BD } ) _ { 1 / e ^ 2 } $ sul campione di circa \SI { 130} { \um } .
Per immettere i fasci di eccitazione nel cammino ottico che porta
all'obiettivo si usa un dicroico di fluorescenza a tre bande,
in grado di riflettere le tre lunghezze d'onda di eccitazione e
trasmettere tre finestre di emissione nel quale ricadono i fluorofori
più comuni.
La fluorescenza riemessa all'indietro dal campione, e quindi trasmessa
dal dicroico di fluorescenza, è combinata con l'illuminazione a luce
trasmessa, da cui sarà disaccopiata per mezzo di un successivo
dicroico.
Il percorso di raccolta dell'emissione di fluorescenza, infatti,
condivide la stesse ottiche di ingrandimento con il percorso di
raccolta della luce trasmessa e quindi lo stesso fattore di
ingrandimento $ \approx 225 x $ .
Uno specchio dicroico con frequenza di taglio di \SI { 705} { \nm }
viene utilizzato per estrarre l'emissione di fluorescenza dal
cammino di raccolta e indirizzarla verso il sensore di una fotocamera
di tipo \textit { Electron-Multiplying Charged Coupled Device (EmCCD)} .
La regione attiva del sensore è di \SI { 8.19x8.19} { \mm } ,
corrispondente ad un quadrato di lato \SI { 36} { \um } . Il diametro
del fascio di eccitazione è significativamente maggiore di questo
valore per massimizzare l'uniformità della potenza con la quale
la regione di interesse viene illuminata.
La camera usata per la rilevazione della fluorescenza è una
ImagEM X2 C9100-23B (Hamamatsu) con sensibilità del singolo
fotoelettrone.
Per poter realizzare gli schemi di illuminazione HILO e TIRF è stato
introdotto, nella parte terminale del percorso di eccitazione, prima
del filtro dicroico, uno specchio mobile controllato elettronicamente.
Azionando questo specchio è possibile ottenere uno spostamento
orizzontale del fascio di eccitazione, e quindi, poiché esso
attraverserà il piano focale posteriore dell'obiettivo in un punto
diverso dal suo centro, si avrà una deflessione angolare del fascio di
eccitazione in uscita dall'obiettivo.
L'emissione dei laser a diodo risulta
\section { Apparto sperimentale}
In figura \ref { fig:setup} è mostrato uno schema integrale
dell'apparato realizzato.
Le componenti principali sono descritte nella sezione \ref { sec:setup} .
Successivamente, nella sezione \ref { sec:stabilization} è descritto il
sistema di stabilizzazione meccanica introdotto per compensare lo
spostamento
del campione dovuto a deriva termica e oscillazioni acustiche.
Nella sezione \ref { sec:calibration} è descritta nel dettaglio la
procedura usata per la calibrazione dei parametri delle trappole
ottiche.
L'esperimento tipico utilizzato per studiare l'interazione tra una
proteina e un microfilamento di actina consiste in un saggio a tre
sfere, o \textit { 3-beads assay} . I dettagli per la realizzazione di
questo esperimento sono illustrati nella sezione
\ref { sec:three-beads} .
\begin { sidewaysfigure} \begin { sidewaysfigure}
\includegraphics [width=1.0\linewidth] { images/Setup.pdf} \includegraphics [width=1.0\linewidth] { images/Setup.pdf}
\caption { Caption}
\caption { Vista d'insieme dell'apparato sperimentale}
\label { fig:setup} \label { fig:setup}
\end { sidewaysfigure} \end { sidewaysfigure}
@ -541,6 +578,6 @@ questo esperimento sono illustrati nella sezione
& FF01-446/510/581/703\\ & FF01-446/510/581/703\\
\end { tabular} \end { tabular}
\caption { Caption} \caption { Caption}
\label { tab:my_ label }
\label { tab:optical_ components }
\end { sidewaystable} \end { sidewaystable}
lorenzo.zolfanelli93
4 years ago
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