From 102ec24d8734aa3017bdb4d126ad5a826860067a Mon Sep 17 00:00:00 2001 From: "lorenzo.zolfanelli93" Date: Tue, 25 Aug 2020 03:44:35 +0000 Subject: [PATCH] Update on Overleaf. --- chapters/1-introduction.tex | 8 ++-- chapters/2-setup.tex | 89 ++++++++++++++++++++++++++----------- references.bib | 69 +++++++++++++++++++++++++++- 3 files changed, 136 insertions(+), 30 deletions(-) diff --git a/chapters/1-introduction.tex b/chapters/1-introduction.tex index 7cada5a..40ab3ea 100644 --- a/chapters/1-introduction.tex +++ b/chapters/1-introduction.tex @@ -35,7 +35,7 @@ di segnali meccanici. Diversi metodi sono stati proposti e realizzati sperimentalmente per osservare l'attività di meccano-trasduzione nei sistemi -biologici \cite{??}, sfruttando tecniche sia \textit{in vivo} che +biologici \cite{Muhamed2017,Arbore2019}, sfruttando tecniche sia \textit{in vivo} che \textit{in vitro}, osservando sia gli effetti macroscopici che le interazioni tra singole molecole. Nonostante ciò, per quanto riguarda le giunzioni cellulari, siamo @@ -228,7 +228,8 @@ di actina del citoscheletro. Oltre a questa connessione diretta esistono altre proteine che mantengono una connessione indiretta, legando ad esempio le catenine -con il citoscheletro. É stato scoperto \cite{??} che le proteine +con il citoscheletro. É stato scoperto +\cite{Goldmann2016,Dumbauld2014} che le proteine \emph{vinculina} e \emph{$\alpha$-actinina} svolgono questa attività. Sebbene la funzione di questi collegamenti indiretti non sia stata @@ -288,7 +289,8 @@ omologhe appartenenti alla cellula adiacente, tra le quali \emph{claudina}, \emph{occludina} e diverse proteine appartenenti alla classe delle \textit{junctional adhesion molecules}, (JAM). Queste proteine di membrana si legano alla proteina \textit{Zona -occludens 1}, ZO-1 che, come mostrato da recenti studi \cite{??}, +occludens 1}, ZO-1 che, come mostrato da recenti studi +\cite{Vasileva2020}, potrebbe modulare la formazione delle giunzioni e occuparsi della trasduzione di segnali meccanici. Inoltre vi sono evidenze sul ruolo di una terza proteina, la diff --git a/chapters/2-setup.tex b/chapters/2-setup.tex index 50db637..221f36b 100644 --- a/chapters/2-setup.tex +++ b/chapters/2-setup.tex @@ -106,14 +106,15 @@ attraversato. La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico può essere modificata attraverso due traslatori controllati -elettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, ??) +elettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, +P-527) per spostamenti veloci e con risoluzione nanometrica, con una corsa di \SI{100}{\um} per asse, e uno di tipo motore passo-passo (Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI{50}{\mm} per asse. Il piano focale può essere modificato variando la posizione dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico -(Physik Instrumente, PIFOC™ ??) con con una corsa di \SI{400}{\um} +(Physik Instrumente, PIFOC™ P-725) con con una corsa di \SI{400}{\um} e risoluzione nanometrica. Il microscopio è stato progettato in modo che al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenza della superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campione @@ -121,7 +122,7 @@ preparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti). I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivo sono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente -?? e ??) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in +E-517 e E-665) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in modalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungo raggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito da Galil Motion Control e equipaggiati di un \textit{encoder} che @@ -242,8 +243,8 @@ figura \ref{fig:aom}). \label{fig:aom} \end{figure} -Una coppia di lenti piano-convesse con distanze focali di -\SIlist{??;??}{\mm} incrementa la dimensione del fascio e rende il +Una coppia di lenti piano-convesse incrementa la dimensione del fascio +e rende il piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il piano delle uscite degli AOM. In questo modo, per qualsiasi deflessione angolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappole @@ -371,7 +372,7 @@ tramite tre collimatori con specifiche diverse. \centering \begin{tabular}{c c c c} \toprule - $\lambda [\si{\nm}]$ & f [\si{\mm}] & $(\textrm{BD})_{1/e^2} ~[\si{\mm}] & M$\\ + $\lambda [\si{\nm}]$ & f [\si{\mm}] & $(\textrm{BD})_{1/e^2} ~[\si{\mm}]$ & M\\ \midrule 488 & 4 & 0.49 & 3.33x\\ 532 & 11 & 1.57 &\\ @@ -380,39 +381,75 @@ tramite tre collimatori con specifiche diverse. \end{tabular} \caption{Collimatori usati per estrarre i fasci alle varie lunghezzed d'onda, con distanza focale indicata dal costruttore - (f) e diametro del fascio (BD) misuratomediante fit gaussiano.} + (f) e diametro del fascio (BD) misurato mediante fit gaussiano del + suo profilo d'intensità.} \label{tab:my_label} \end{table} I fasci a \SIlist{488;635}{\nm} vengono ingranditi mediante due telescopi realizzati con lenti piano-convesse. +L'emissione dei laser a diodo deve essere filtrata attraverso +filtri passa-banda stretti per evitare che radiazione a lunghezze +d'onda spurie diffonda nel campione e contamini l'emissione di +fluroescenza. + +I tre fasci laser vengono combinati in un unico percorso ottico e +ingranditi di un fattore 10x per mezzo di un ulteriore telescopio +sul percorso comune, raggiungendo un diametro $\approx \SI{2}{\cm}$. + +I fasci combinati sono focalizzati sul piano focale posteriore +dell'obiettivo da una lente con $f = \SI{500}{\mm}$, ottenendo +un fattore di scala di circa $1/150$ e quindi un diametro +$(\textrm{BD})_{1/e^2}$ sul campione di circa \SI{130}{\um}. +Per immettere i fasci di eccitazione nel cammino ottico che porta +all'obiettivo si usa un dicroico di fluorescenza a tre bande, +in grado di riflettere le tre lunghezze d'onda di eccitazione e +trasmettere tre finestre di emissione nel quale ricadono i fluorofori +più comuni. +La fluorescenza riemessa all'indietro dal campione, e quindi trasmessa +dal dicroico di fluorescenza, è combinata con l'illuminazione a luce +trasmessa, da cui sarà disaccopiata per mezzo di un successivo +dicroico. + +Il percorso di raccolta dell'emissione di fluorescenza, infatti, +condivide la stesse ottiche di ingrandimento con il percorso di +raccolta della luce trasmessa e quindi lo stesso fattore di +ingrandimento $\approx 225x$. + +Uno specchio dicroico con frequenza di taglio di \SI{705}{\nm} +viene utilizzato per estrarre l'emissione di fluorescenza dal +cammino di raccolta e indirizzarla verso il sensore di una fotocamera +di tipo \textit{Electron-Multiplying Charged Coupled Device (EmCCD)}. + +La regione attiva del sensore è di \SI{8.19x8.19}{\mm}, +corrispondente ad un quadrato di lato \SI{36}{\um}. Il diametro +del fascio di eccitazione è significativamente maggiore di questo +valore per massimizzare l'uniformità della potenza con la quale +la regione di interesse viene illuminata. + +La camera usata per la rilevazione della fluorescenza è una +ImagEM X2 C9100-23B (Hamamatsu) con sensibilità del singolo +fotoelettrone. + +Per poter realizzare gli schemi di illuminazione HILO e TIRF è stato +introdotto, nella parte terminale del percorso di eccitazione, prima +del filtro dicroico, uno specchio mobile controllato elettronicamente. +Azionando questo specchio è possibile ottenere uno spostamento +orizzontale del fascio di eccitazione, e quindi, poiché esso +attraverserà il piano focale posteriore dell'obiettivo in un punto +diverso dal suo centro, si avrà una deflessione angolare del fascio di +eccitazione in uscita dall'obiettivo. + -L'emissione dei laser a diodo risulta -\section{Apparto sperimentale} -In figura \ref{fig:setup} è mostrato uno schema integrale -dell'apparato realizzato. -Le componenti principali sono descritte nella sezione \ref{sec:setup}. -Successivamente, nella sezione \ref{sec:stabilization} è descritto il -sistema di stabilizzazione meccanica introdotto per compensare lo -spostamento -del campione dovuto a deriva termica e oscillazioni acustiche. -Nella sezione \ref{sec:calibration} è descritta nel dettaglio la -procedura usata per la calibrazione dei parametri delle trappole -ottiche. -L'esperimento tipico utilizzato per studiare l'interazione tra una -proteina e un microfilamento di actina consiste in un saggio a tre -sfere, o \textit{3-beads assay}. I dettagli per la realizzazione di -questo esperimento sono illustrati nella sezione -\ref{sec:three-beads}. \begin{sidewaysfigure} \includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/Setup.pdf} - \caption{Caption} + \caption{Vista d'insieme dell'apparato sperimentale} \label{fig:setup} \end{sidewaysfigure} @@ -541,6 +578,6 @@ questo esperimento sono illustrati nella sezione & FF01-446/510/581/703\\ \end{tabular} \caption{Caption} - \label{tab:my_label} + \label{tab:optical_components} \end{sidewaystable} diff --git a/references.bib b/references.bib index 341d9e3..532e881 100644 --- a/references.bib +++ b/references.bib @@ -7,7 +7,7 @@ publisher = {OSA}, title = {Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles}, volume = {11}, - month = {May}, + month = {5}, year = {1986}, _url = {http://ol.osa.org/abstract.cfm?URI=ol-11-5-288}, doi = {10.1364/OL.11.000288}, @@ -96,4 +96,71 @@ url = {http://www.galil.com/sw/pub/all/doc/gclib/html/index.html}, title = {Communications API for Galil controllers and PLCs}, author = {GalilMC} +} + + +@article{Muhamed2017, + doi = {10.3390/bioengineering4010012}, + _url = {https://doi.org/10.3390/bioengineering4010012}, + year = {2017}, + month = feb, + publisher = {{MDPI} {AG}}, + volume = {4}, + number = {4}, + pages = {12}, + author = {Ismaeel Muhamed and Farhan Chowdhury and Venkat Maruthamuthu}, + title = {Biophysical Tools to Study Cellular Mechanotransduction}, + journal = {Bioengineering} +} + +@article{Arbore2019, + doi = {10.1007/s12551-019-00599-y}, + _url = {https://doi.org/10.1007/s12551-019-00599-y}, + year = {2019}, + month = oct, + publisher = {Springer Science and Business Media {LLC}}, + volume = {11}, + number = {5}, + pages = {765--782}, + author = {Claudia Arbore and Laura Perego and Marios Sergides and Marco Capitanio}, + title = {Probing force in living cells with optical tweezers: from single-molecule mechanics to cell mechanotransduction}, + journal = {Biophysical Reviews} +} + +@article{Goldmann2016, + doi = {10.1002/cbin.10563}, + _url = {https://doi.org/10.1002/cbin.10563}, + year = {2016}, + month = jan, + publisher = {Wiley}, + volume = {40}, + number = {3}, + pages = {241--256}, + author = {Wolfgang H. Goldmann}, + title = {Role of vinculin in cellular mechanotransduction}, + journal = {Cell Biology International} +} + +@article{Dumbauld2014, + doi = {10.4161/cam.29139}, + _url = {https://doi.org/10.4161/cam.29139}, + year = {2014}, + month = oct, + publisher = {Informa {UK} Limited}, + volume = {8}, + number = {6}, + pages = {550--557}, + author = {David W Dumbauld and Andr{\'{e}}s J Garc{\'{\i}}a}, + title = {A helping hand: How vinculin contributes to cell-matrix and cell-cell force transfer}, + journal = {Cell Adhesion {\&} Migration} +} + +@article{Vasileva2020, + doi = {10.1101/2020.05.14.095364}, + _url = {https://doi.org/10.1101/2020.05.14.095364}, + year = {2020}, + month = 5, + publisher = {Cold Spring Harbor Laboratory}, + author = {Ekaterina Vasileva and Florian Rouaud and Domenica Spadaro and Wenmao Huang and Adai Colom and Arielle Flinois and Jimit Shah and Vera Dugina and Christine Chaponnier and Sophie Sluysmans and Isabelle M{\'{e}}an and Lionel Jond and Aur{\'{e}}lien Roux and Jie Yan and Sandra Citi}, + title = {Cingulin unfolds {ZO}-1 and organizes myosin-2B and $\upgamma$-actin to mechanoregulate apical and tight junction membranes} } \ No newline at end of file