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\chapter{Conclusione e prospettive future}
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\label{cap:results}
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Nello svolgimento di questo lavoro di tesi è stata esplorata la possibilità
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di utilizzare tecniche di microscopia e manipolazione ottica avanzate e
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ultraveloci per caratterizzare le proprietà meccaniche di complessi di
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biomolecole interagenti.
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Queste proprietà, in particolare la modulabilità delle proprietà dinamiche
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delle interazioni attraverso l'applicazione di stimoli meccanici controllati,
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sono alla base della \textit{meccanotrasduzione}, ovvero di ogni processo
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che consente la traduzione di un segnale di tipo meccanico in segnali
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biochimici capaci di alterare il funzionamento di cellule e organismi.
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Per decifrare i meccanismi fondamentali alla base della meccanotrasduzione
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è stato considerato un approccio in cui un insieme minimo
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``funzionale'' di biomolecole viene isolato dal resto del rumoroso ambiente
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cellulare, in modo da poter controllare con estrema precisione la posizione
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e il numero delle molecole interagenti, e da poter rilevare e caratterizzare
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anche interazioni transienti e di breve intensità, con tempi di vita media
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inferiori al millisecondo.
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La scelta di un approccio di questo tipo, se da una parte consente
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l'osservazione e la caratterizzazione di meccanismi di interazione altrimenti
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invisibili, è però intrinsecamente limitata dalla necessità di porre il
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sistema in condizioni molto diverse da quelle fisiologiche, in cui un numero
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elevato di molecole diverse in natura è responsabile delle proprietà
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meccaniche dei tessuti cellulari e della formazione e modulazione di segnali
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biochimici.
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Con questo lavoro di tesi si è voluto mostrare come questa limitazione sia
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tecnicamente superabile andando ad accoppiare, a tecniche di spettroscopia
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di forza già regolarmente utilizzate, schemi di microscopia di singola
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molecola.
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Così facendo, infatti, è possibile aumentare il numero di molecole
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osservate nello stesso tempo: mentre l'interazione tra due molecole viene
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monitorata accuratamente sotto condizioni meccaniche controllate,
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l'eventuale attivazione di cofattori terzi interagenti può essere rilevata
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grazie alla microscopia di fluorescenza.
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Correlando temporalmente queste due informazioni in un unico esperimento, è
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possibile caratterizzare e quantificare un insieme di meccanismi fondamentali
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per la meccanotrasduzione molto più ampio di quello esplorabile con le
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due tecniche separatamente.
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Per combinare efficacemente un sistema di spettroscopia di forza
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ultraveloce basato su pinzette ottiche con schemi di microscopia di singola
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molecola è necessario confrontarsi con una serie di limitazioni sia di
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natura ingegneristica che teorica.
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In particolare, è necessario evitare ogni possibile \textit{crosstalk} tra
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le differenti modalità di acquisizione usate allo stesso tempo senza però
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ridurre la qualità, in termini di rapporto segnale/rumore,
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dei dati acquisiti.
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Per questo motivo, anche se le tecniche di microscopia di singola molecola
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e di spettroscopia di forza risultano usate routinariamente da qualche
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tempo, non è stata ancora ancora sufficientemente esplorata la possibilità
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di un loro uso combinato in biofisica.
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Con questo lavoro di tesi si è realizzato un apparato di misura in grado
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di combinare la rilevazione in fluorescenza di singola molecola alla
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spettroscopia di forza \textit{force-clamp}, dimostrando la possibilità
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di ottenere misure di interazione con la stessa precisione e sensibilità
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raggiungibili in un apparato di spettroscopia force-clamp isolato.
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Inoltre, è stata esplorata la possibilità di sfruttare le proprietà ottiche
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dei materiali usati negli esperimenti per incrementare il rapporto
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segnale/rumore in microscopia di fluorescenza. A questo riguardo, ulteriori
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approfondimenti sulla possibilità di usare microsfere dielettriche come
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risuonatori ottici si rendono necessari e potranno essere oggetto di uno
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studio futuro.
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Un sistema sul quale può essere estremamente proficuo applicare questo tipo
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di misurazioni è quello delle giunzioni cellulari, in particolare quelle
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\textit{aderenti} o \textit{serrate}, dove l'interazione tra diverse specie
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di proteine è fondamentale per ottenere un ampia gamma di proprietà meccaniche
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osservabili nei tessuti viventi. In questi sistemi, nonostante la complessità
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e varietà degli effetti macroscopici osservabili, è ancora possibile
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individuare sottoinsiemi di specie di proteine sufficientemente limitati per
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poter essere studiati con un metodo come quello descritto in questo lavoro.
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Le giunzioni cellulari presentano ancora molti aspetti incompresi, soprattutto
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manca ancora una accurata descrizione a livello molecolare dei meccanismi
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di interazione responsabili della meccanotrasduzione. Proprio per questo
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motivo rappresentano un ottimo banco di prova per l'applicazione delle
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metodiche descritte.
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Per quanto riguarda le \textit{giunzioni aderenti},
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l'osservazione diretta di come il legame tra le proteine \textit{vinculina}
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e $\alpha$\textit{-catenina} possa modulare l'interazione di quest'ultima
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con i filamenti di \textit{actina} potrebbe permettere di determinare il ruolo,
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ancora non chiaro, della \textit{vinculina} nella regolazione delle proprietà
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della giunzione. Una realizzazione sperimentale di questa misura
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è possibile utilizzando l'apparato realizzato e marcando con una sonda
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fluorescente la \textit{vinculina}, mentre allo stesso tempo la cinetica
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dell'interazione actina-$\alpha$\textit{-catenina} viene registrata con il
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sistema di spettroscopia \textit{force-clamp} (figura \ref{fig:aj_exp}).
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Analogamente, nel caso delle \textit{giunzioni serrate},
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il ruolo della proteina \textit{cingulina} nel regolare l'attività della
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proteina ZO-1, responsabile di connettere il dominio extra-cellulare della
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giunzione alle strutture di sostegno intra-cellulari, non è ancora
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completamente chiaro.
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In questo caso è possibile ipotizzare, sempre utilizzando l'apparato
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sperimentale realizzato, una misura in cui la cinetica dell'interazione
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tra la proteina ZO-1 (o di un frammento di essa) con filamenti di actina
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viene registrata osservando, contemporaneamente, l'eventuale presenza
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di cingulina marcata con sonde fluorescenti in prossimità della regione
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di interazione.
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In conclusione, si ritiene che l'approccio sperimentale descritto in questa
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tesi abbia le caratteristiche necessarie per rispondere ai quesiti ancora
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aperti sul funzionamento, a livello molecolare, di diversi meccanismi
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di \textit{meccanotrasduzione}, e possa fornire misure quantitative sul
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rapporto tra forze esterne applicate, cinetiche di interazione e regolazione
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delle funzioni cellulari.
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