You can not select more than 25 topics
Topics must start with a letter or number, can include dashes ('-') and can be up to 35 characters long.
133 lines
7.0 KiB
133 lines
7.0 KiB
\chapter{Conclusione e prospettive future}
|
|
\label{cap:results}
|
|
|
|
Nello svolgimento di questo lavoro di tesi è stata esplorata la possibilità
|
|
di utilizzare tecniche di microscopia e manipolazione ottica avanzate e
|
|
ultraveloci per caratterizzare le proprietà meccaniche di complessi di
|
|
biomolecole interagenti.
|
|
|
|
Queste proprietà, in particolare la modulabilità delle proprietà dinamiche
|
|
delle interazioni attraverso l'applicazione di stimoli meccanici controllati,
|
|
sono alla base della \textit{meccanotrasduzione}, ovvero di ogni processo
|
|
che consente la traduzione di un segnale di tipo meccanico in segnali
|
|
biochimici capaci di alterare il funzionamento di cellule e organismi.
|
|
|
|
Per decifrare i meccanismi fondamentali alla base della meccanotrasduzione
|
|
è stato considerato un approccio in cui un insieme minimo
|
|
``funzionale'' di biomolecole viene isolato dal resto del rumoroso ambiente
|
|
cellulare, in modo da poter controllare con estrema precisione la posizione
|
|
e il numero delle molecole interagenti, e da poter rilevare e caratterizzare
|
|
anche interazioni transienti e di breve intensità, con tempi di vita media
|
|
inferiori al millisecondo.
|
|
|
|
La scelta di un approccio di questo tipo, se da una parte consente
|
|
l'osservazione e la caratterizzazione di meccanismi di interazione altrimenti
|
|
invisibili, è però intrinsecamente limitata dalla necessità di porre il
|
|
sistema in condizioni molto diverse da quelle fisiologiche, in cui un numero
|
|
elevato di molecole diverse in natura è responsabile delle proprietà
|
|
meccaniche dei tessuti cellulari e della formazione e modulazione di segnali
|
|
biochimici.
|
|
|
|
Con questo lavoro di tesi si è voluto mostrare come questa limitazione sia
|
|
tecnicamente superabile andando ad accoppiare, a tecniche di spettroscopia
|
|
di forza già regolarmente utilizzate, schemi di microscopia di singola
|
|
molecola.
|
|
Così facendo, infatti, è possibile aumentare il numero di molecole
|
|
osservate nello stesso tempo: mentre l'interazione tra due molecole viene
|
|
monitorata accuratamente sotto condizioni meccaniche controllate,
|
|
l'eventuale attivazione di cofattori terzi interagenti può essere rilevata
|
|
grazie alla microscopia di fluorescenza.
|
|
|
|
Correlando temporalmente queste due informazioni in un unico esperimento, è
|
|
possibile caratterizzare e quantificare un insieme di meccanismi fondamentali
|
|
per la meccanotrasduzione molto più ampio di quello esplorabile con le
|
|
due tecniche separatamente.
|
|
|
|
Per combinare efficacemente un sistema di spettroscopia di forza
|
|
ultraveloce basato su pinzette ottiche con schemi di microscopia di singola
|
|
molecola è necessario confrontarsi con una serie di limitazioni sia di
|
|
natura ingegneristica che teorica.
|
|
In particolare, è necessario evitare ogni possibile \textit{crosstalk} tra
|
|
le differenti modalità di acquisizione usate allo stesso tempo senza però
|
|
ridurre la qualità, in termini di rapporto segnale/rumore,
|
|
dei dati acquisiti.
|
|
|
|
Per questo motivo, anche se le tecniche di microscopia di singola molecola
|
|
e di spettroscopia di forza risultano usate routinariamente da qualche
|
|
tempo, non è stata ancora ancora sufficientemente esplorata la possibilità
|
|
di un loro uso combinato in biofisica.
|
|
|
|
Con questo lavoro di tesi si è realizzato un apparato di misura in grado
|
|
di combinare la rilevazione in fluorescenza di singola molecola alla
|
|
spettroscopia di forza \textit{force-clamp}, dimostrando la possibilità
|
|
di ottenere misure di interazione con la stessa precisione e sensibilità
|
|
raggiungibili in un apparato di spettroscopia force-clamp isolato.
|
|
|
|
Inoltre, è stata esplorata la possibilità di sfruttare le proprietà ottiche
|
|
dei materiali usati negli esperimenti per incrementare il rapporto
|
|
segnale/rumore in microscopia di fluorescenza. A questo riguardo, ulteriori
|
|
approfondimenti sulla possibilità di usare microsfere dielettriche come
|
|
risuonatori ottici si rendono necessari e potranno essere oggetto di uno
|
|
studio futuro.
|
|
|
|
Un sistema sul quale può essere estremamente proficuo applicare questo tipo
|
|
di misurazioni è quello delle giunzioni cellulari, in particolare quelle
|
|
\textit{aderenti} o \textit{occludenti}, dove l'interazione tra diverse specie
|
|
di proteine è fondamentale per ottenere un ampia gamma di proprietà meccaniche
|
|
osservabili nei tessuti viventi. In questi sistemi, nonostante la complessità
|
|
e varietà degli effetti macroscopici osservabili, è ancora possibile
|
|
individuare sottoinsiemi di specie di proteine sufficientemente limitati per
|
|
poter essere studiati con un metodo come quello descritto in questo lavoro.
|
|
|
|
Le giunzioni cellulari presentano ancora molti aspetti incompresi, soprattutto
|
|
manca ancora una accurata descrizione a livello molecolare dei meccanismi
|
|
di interazione responsabili della meccanotrasduzione. Proprio per questo
|
|
motivo rappresentano un ottimo banco di prova per l'applicazione delle
|
|
metodiche descritte.
|
|
|
|
Per quanto riguarda le \textit{giunzioni aderenti},
|
|
l'osservazione diretta di come il legame tra le proteine \textit{vinculina}
|
|
e $\alpha$\textit{-catenina} possa modulare l'interazione di quest'ultima
|
|
con i filamenti di \textit{actina} potrebbe permettere di determinare il ruolo,
|
|
ancora non chiaro, della \textit{vinculina} nella regolazione delle proprietà
|
|
della giunzione. Una realizzazione sperimentale di questa misura
|
|
è possibile utilizzando l'apparato realizzato e marcando con una sonda
|
|
fluorescente la \textit{vinculina}, mentre allo stesso tempo la cinetica
|
|
dell'interazione actina-$\alpha$\textit{-catenina} viene registrata con il
|
|
sistema di spettroscopia \textit{force-clamp} (figura \ref{fig:exp_aj}).
|
|
|
|
\begin{figure}[ht]
|
|
\centering
|
|
\includegraphics[width=0.6\linewidth]{images/exp_aj.pdf}
|
|
\caption{Ipotesi di esperimento per lo studio dell'interazione tra
|
|
alfa-catenina, actina e vinculina.}
|
|
\label{fig:exp_aj}
|
|
\end{figure}
|
|
|
|
Analogamente, nel caso delle \textit{giunzioni occludenti},
|
|
il ruolo della proteina \textit{cingulina} nel regolare l'attività della
|
|
proteina ZO-1, responsabile di connettere il dominio extra-cellulare della
|
|
giunzione alle strutture di sostegno intra-cellulari, non è ancora
|
|
completamente chiaro.
|
|
In questo caso è possibile ipotizzare, sempre utilizzando l'apparato
|
|
sperimentale realizzato, una misura in cui la cinetica dell'interazione
|
|
tra la proteina ZO-1 (o di un frammento di essa) con filamenti di actina
|
|
viene registrata osservando, contemporaneamente, l'eventuale presenza
|
|
di cingulina marcata con sonde fluorescenti in prossimità della regione
|
|
di interazione (figura \ref{fig:exp_tj}).
|
|
|
|
\begin{figure}[ht]
|
|
\centering
|
|
\includegraphics[width=0.6\linewidth]{images/exp_tj.pdf}
|
|
\caption{Ipotesi di esperimento per lo studio dell'interazione tra
|
|
ZO-1, actina e cingulina.}
|
|
\label{fig:exp_tj}
|
|
\end{figure}
|
|
|
|
In conclusione, si ritiene che l'approccio sperimentale descritto in questa
|
|
tesi abbia le caratteristiche necessarie per rispondere ai quesiti ancora
|
|
aperti sul funzionamento, a livello molecolare, di diversi meccanismi
|
|
di \textit{meccanotrasduzione}, e possa fornire misure quantitative sul
|
|
rapporto tra forze esterne applicate, cinetiche di interazione e regolazione
|
|
delle funzioni cellulari.
|
|
|