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\chapter{Apparato sperimentale}
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\label{cap:methods}
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L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopio
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invertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanica
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del LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistema
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di due pinzette ottiche posizionabili elettronicamente e con uno
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schema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungere
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la sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemi
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di illuminazione (campo largo, TIRF, HILO).
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Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura
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\ref{fig:microscope}.
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Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e il
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funzionamento simultaneo - senza interferenze - dei tre principali
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schemi di microscopia e manipolazione:
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\begin{description}
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\item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una
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sorgente LED a spettro largo viene collimata da un
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condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso
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il campione.
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L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce
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trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita del
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contrasto di densità dello stesso.
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\item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono
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collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo,
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quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono
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essere usati per intrappolare e manipolare microsfere
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in soluzione. La radiazione laser diffusa che attraversa
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il campione e viene raccolta dal condensatore può essere
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analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo
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spostamento dal centro delle sfere intrappolate.
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\item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene
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focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e
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quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La
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radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione
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viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso
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un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio
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di eccitazione.
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\end{description}
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\begin{figure}[ht]
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\centering
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\includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf}
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\caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi
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ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.}
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\label{fig:microscope}
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\end{figure}
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Per evitare interferenze tra i tre schemi è stato necessario
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scegliere opportune lunghezze d'onda per la radiazione di
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illuminazione e, di conseguenza, appropriati specchi dicroici
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e filtri.
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L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando una
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sorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm},
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le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un laser
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a stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per la
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microscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgenti
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laser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} e
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l'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccolta
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e disaccopiata dall'illuminazione a luce trasmessa.
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\section{Microscopio e traslatori}
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Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituiscono
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il microscopio sono assemblati su una struttura metallica
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personalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS.
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Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattro
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elastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuare
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significativamente le vibrazioni meccaniche.
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Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimento
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attraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa.
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Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarie
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per gli esperimenti viene caricata in una camera di reazione
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realizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti).
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Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraverso
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quattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore corto raggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il
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\textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}.
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La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico
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può essere modificata attraverso due traslatori controllati
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elettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, ??)
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per spostamenti veloci e con precisione nanometrica, con una corsa di
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\SI{100}{\um} per asse, e uno di tipo motore passo-passo
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(Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI{50}{\mm} per asse.
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Il piano focale può essere modificato variando la posizione
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dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico
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(Physik Instrumente, PIFOC™ ??) con con una corsa di \SI{400}{\um}
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e risoluzione nanometrica.
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I due pos
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\section{Force-clamp}
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In figura \ref{fig:setup} è mostrato uno schema integrale
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dell'apparato realizzato.
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Le componenti principali sono descritte nella sezione \ref{sec:setup}.
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Successivamente, nella sezione \ref{sec:stabilization} è descritto il
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sistema di stabilizzazione meccanica introdotto per compensare lo
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spostamento
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del campione dovuto a deriva termica e oscillazioni acustiche.
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Nella sezione \ref{sec:calibration} è descritta nel dettaglio la
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procedura usata per la calibrazione dei parametri delle trappole
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ottiche.
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L'esperimento tipico utilizzato per studiare l'interazione tra una
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proteina e un microfilamento di actina consiste in un saggio a tre
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sfere, o \textit{3-beads assay}. I dettagli per la realizzazione di
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questo esperimento sono illustrati nella sezione \ref{sec:3beads}.
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\section{Apparato sperimentale}
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\label{sec:setup}
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L'apparato sperimentale è stato realizzato presso i laboratori del
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LENS, sulla base dell'apparato utilizzato in precedenza dal di
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Biofisica di Singola Molecola per lo studio delle interazioni tra
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miosina e filamenti di actina e repressori della trascrizione
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e filamenti di DNA.
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L'apparto si compone di N parti principali:
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\begin{description}
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\item[Pinzette ottiche:] Una coppia di fasci gaussiani a \SI{1064}{\nm}, ottenuti da un laser a stato solido,
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\end{description}
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\begin{sidewaysfigure}
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\includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/Setup.pdf}
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\caption{Caption}
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\label{fig:setup}
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\end{sidewaysfigure}
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\begin{sidewaystable}
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\centering
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\begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l}
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\toprule
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Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\
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\midrule
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\multicolumn{5}{l}{\it Fluorescence Excitation Path}\\
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F-Clean635
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& Bandpass Filter
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& \SI{635}{\nm} laser clean-up
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& $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm},
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bw: \SI{14}{\nm}$
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& FF01-640/14-25\\
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L-TS1a
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|
& Plano-Convex Spherical Lens
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& Telescope for \SI{635}{\nm} laser
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|
& f: \SI{0}{\mm}
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|
& \\
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|
L-TS1b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS2a
|
|
&
|
|
& Telescope for \SI{488}{\nm} laser
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS2b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
DIC-532
|
|
& Single-edge Dichroic Filter
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|
& Excitation beam multiplexing
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|
& $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$
|
|
& Di02-R532-25-D\\
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|
DIC-488
|
|
& &
|
|
& $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$
|
|
& Di02-R488-25-D\\
|
|
L-TS3a
|
|
& Achromatic Doublet
|
|
& Telescope for comb. ex. lasers
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS3b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-Exc
|
|
&
|
|
& Excitation beam focusing
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
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|
DIC-Fluor
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|
& Quad-edge Dichroic Filter
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|
& Excitation/Emission separation
|
|
& $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$
|
|
& Di03-R405/488/532/635-t1 \\
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|
\multicolumn{5}{l}{\it Tweezers Path}\\
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|
L-TS4a
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|
& Plano-Convex Spherical Lens
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|
& Telescope matching isolator size
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|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS4b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS5a
|
|
& Plano-Convex Spherical Lens
|
|
& Telescope after isolator
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS5b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-Twz1
|
|
& Plano-Convex Spherical Lens
|
|
& Telescope after isolator
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-Twz2
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
DIC-Twz1
|
|
& Single-edge Dichroic Filter
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|
& Tweezer beam insertion
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|
& $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$
|
|
& \\
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|
\multicolumn{5}{l}{\it Imaging Path}\\
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L-Im1
|
|
& Tube Lens
|
|
& Tube Lens
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
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|
L-Im2
|
|
& Imaging Lens
|
|
& Imaging Lens
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
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DIC-BF
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& Single-edge Dichroic Filter
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& Fluorescence/Brightfield demux
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& $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$
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& FF705-Di01-25x36\\
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F-BlockBF
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& Shortpass Filter
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& Residual brightfield suppression
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& $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$
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|
& FESH0700\\
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F-Emiss
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& Quad-band bandpass Filter
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& Fluorophore emission filtering
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|
& $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$
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|
& FF01-446/510/581/703\\
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|
F-BlockTwz
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|
& Bandstop filter
|
|
& Fluorophore emission filtering
|
|
& $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$
|
|
& FF01-446/510/581/703\\
|
|
\end{tabular}
|
|
\caption{Caption}
|
|
\label{tab:my_label}
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|
\end{sidewaystable}
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|
|
\section{Stabilizzazione meccanica}
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\label{sec:stabilization}
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