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\chapter{Metodi}
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\label{cap:methods}
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\section{Stabilizzazione meccanica}
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\label{sec:stabilization}
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Nonostante l'isolamento meccanico fornito dagli
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elastomeri e dal tavolo ottico la posizione del campione
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rispetto al centro dell'obiettivo e la quota del piano
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focale sono soggette a fluttuazioni e derive.
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Gli effetti più evidenti e rilevabili sono rapide
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oscillazioni della posizione del campione dovute a
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vibrazioni acustiche residue e una progressive deriva
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rispetto alla posizione fissata che diventa significativa
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($> \SI{100}{\nm}$) per tempi di osservazione di
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diversi minuti.
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Per quantificare quest'effetto viene usato un apposito
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campione in cui diverse microsfere in silice, di diametro
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\SI{0.5}{\um}, vengono immobilizzate in uno strato di
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nitrocellulosa depositato nella superficie interna
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del vetrino coprioggetti. Le varie fasi per la
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preparazione di questo campione sono descritte nei
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particolari nell'appendice \ref{app:protocols} relativa
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ai protocolli, alla sezione
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\ref{sec:proto:silica_beads_flow}.
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Le microsfere immobilizzate nel campione possono
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essere messe a fuoco e visualizzate attraverso il
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sistema di microscopia a luce trasmessa.
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Una volta selezionata e messa a fuoco una microsfera,
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analizzando l'immagine prodotta da uno dei due sensori
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CMOS è possibile calcolare le coordinate (in pixel)
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del suo centroide:
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\begin{equation}
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(x_{cen}, y_{cen}) =
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\frac{
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\sum_{(x, y)} (x, y) I(x, y)
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}{
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\sum_{(x, y)} I(x, y)
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}
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\end{equation}
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Per evitare di considerare altre microsfere o
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imperfezioni sul campione si sceglie di effettuare il
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calcolo del centroide limitando la regione dell'immagine
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utilizzata a un rettangolo nel quale una microsfera è
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sufficientemente isolata.
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Ricalcolando il centroide intervalli temporali fissati
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è possibile osservare la deriva della posizione (x, y)
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della microsfera. Inoltre è possibile sfruttare questo
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stesso campione per effettuare una calibrazione del
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fattore di conversione pixel/nm lungo due assi
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ortogonali.
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\section{Calibrazione parametri trappole}
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\label{sec:calibration}
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\section{Retroazione AOM e \textit{force-clamp}}
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\label{sec:force-clamp}
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\section{Saggio a tre sfere}
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\label{sec:three-beads}
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\section{Fluorescenza di singola molecole}
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\label{sec:single_molecule_fluorescence}
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\section{TIRF e illuminazione a modi di galleria}
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\label{sec:gallery_mode}
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