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\chapter{Apparato sperimentale}
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\label{cap:methods}
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L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopio
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invertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanica
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del LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistema
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di due pinzette ottiche posizionabili elettronicamente e con uno
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schema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungere
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la sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemi
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di illuminazione (campo largo, TIRF, HILO).
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Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura
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\ref{fig:microscope}.
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Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e il
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funzionamento simultaneo - senza interferenze - dei tre principali
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schemi di microscopia e manipolazione:
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\begin{description}
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\item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una
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sorgente LED a spettro largo viene collimata da un
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condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso
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il campione.
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L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce
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trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita del
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contrasto di densità dello stesso.
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\item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono
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collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo,
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quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono
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essere usati per intrappolare e manipolare microsfere
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in soluzione. La radiazione laser diffusa che attraversa
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il campione e viene raccolta dal condensatore può essere
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analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo
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spostamento dal centro delle sfere intrappolate.
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\item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene
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focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e
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quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La
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radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione
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viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso
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un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio
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di eccitazione.
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\end{description}
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\begin{figure}[ht]
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\centering
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\includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf}
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\caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi
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ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.}
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\label{fig:microscope}
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\end{figure}
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Per evitare interferenze tra i tre schemi è stato necessario
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scegliere opportune lunghezze d'onda per la radiazione di
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illuminazione e, di conseguenza, appropriati specchi dicroici
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e filtri.
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L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando una
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sorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm},
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le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un laser
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a stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per la
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microscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgenti
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laser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} e
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l'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccolta
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e disaccopiata dall'illuminazione a luce trasmessa.
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\section{Microscopio e traslatori}
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Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituiscono
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il microscopio sono assemblati su una struttura metallica
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personalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS.
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Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattro
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elastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuare
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significativamente le vibrazioni meccaniche.
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Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimento
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attraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa.
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Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarie
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per gli esperimenti viene caricata in una camera di reazione
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realizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti).
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Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraverso
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quattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore corto
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raggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il
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\textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}.
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Per gli scopi di questa tesi sono stati usati due obiettivi
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differenti:
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\begin{itemize}
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\item Un obiettivo planapocromatico 60x a immersione ad acqua,
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con alta apertura numerica ($NA = 1.22$) e distanza di lavoro
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di \SI{0.2}{\mm} (Nikon)
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\item Un obiettivo TIRF (??) a immersione a olio (Nikon)
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\end{itemize}
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Il primo obiettivo presenta le caratteristiche migliori per quanto
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riguarda l'efficienza delle pinzette ottiche, anche a profondità
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significative all'interno del campione.
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Il secondo obiettivo invece permette la realizzazione di schemi di
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illuminazione TIRF, al prezzo di un'efficienza delle pinzette ottiche
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che decresce rapidamente all'aumentare del volume di campione
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attraversato.
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La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico
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può essere modificata attraverso due traslatori controllati
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elettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, ??)
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per spostamenti veloci e con risoluzione nanometrica, con una corsa di
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\SI{100}{\um} per asse, e uno di tipo motore passo-passo
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(Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI{50}{\mm} per asse.
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Il piano focale può essere modificato variando la posizione
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dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico
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(Physik Instrumente, PIFOC™ ??) con con una corsa di \SI{400}{\um}
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e risoluzione nanometrica. Il microscopio è stato progettato in modo
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che al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenza
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della superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campione
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preparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti).
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I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivo
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sono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente
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?? e ??) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in
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modalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungo
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raggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito da
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Galil Motion Control e equipaggiati di un \textit{encoder} che
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permette la selezione e il monitoraggio della velocità di spostamento.
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Le tre unità di controllo sono connesse ad un PC mediante interfaccia
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seriale RS232 e possono essere programmate e controllate usando
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i protocolli di comunicazione GCS per i moduli Physik Instrumente
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e GC \cite{gclib} per il modulo Galil Motion Control.
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Per semplificare l'utilizzo dei tre gli attuatori durante
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la manipolazione di un campione è stato sviluppato un software
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in ambiente LabVIEW che implementa i protocolli di comunicazione
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richiesti.
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In particolare il software sviluppato consente di utilizzare
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levette analogiche e cursori di un \textit{controller} della console
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Xbox 360 (Microsoft) per inviare comandi agli attuatori, rendendo la
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manipolazione del campione particolarmente semplice e intuitiva.
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\section{Illuminazione a luce trasmessa}
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La radiazione emessa da un LED ad alta intensità (Thorlabs, M780L3)
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con picco di emissione centrato nell'infrarosso, a \SI{780}{nm},
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viene filtrata con un filtro passa-basso (Thorlabs, FEHL0750) in modo
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da sopprimere l'emissione a lunghezze d'onda inferiori a \SI{750}{nm}
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che andrebbe a interferire con il rilevamento della fluorescenza.
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Successivamente, con l'ausilio di una singola lente e un accoppiatore
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in fibra (Thorlabs), la radiazione emessa dal LED e filtrata
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viene immessa in una fibra ottica e trasportata in corrispondenza del
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microscopio. All'altra estremità della fibra un sistema formato da un
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collimatore, un diaframma e una lente aggiusta le dimensioni e la
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divergenza del fascio di illuminazione, direzionandolo collimato verso
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il piano focale posteriore del condensatore.
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Il fascio di illuminazione viene quindi focalizzato sul campione, lo
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attraversa e la radiazione trasmessa e diffusa viene raccolta
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dall'obiettivo.
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Gli obiettivi usati sono corretti all'infinito, questo significa
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che i raggi in uscita dall'obiettivo sono collimati.
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Inserendo nel percorso ottico una \textit{lente di tubo} l'immagine
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viene messa a fuoco in un piano ben preciso.
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La distanza focale dell'obiettivo è di \SI{3.3}{\mm}, quella della
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lente di tubo di \SI{250}{\mm}.
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Otteniamo quindi la formazione di un immagine del piano del campione
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selezionato a una distanza di \SI{250}{\mm} dalla lente e con un
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fattore di ingrandimento $M = 250/3.3 \approx 75$.
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Questa immagine viene ulteriormente ingrandita mediante l'uso di
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un'ulteriore lente con distanza focale \SI{75}{\mm} posta a
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\SI{350}{mm} dalla lente di tubo.
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In questo modo si ottiene, a una distanza di \SI{30}{\cm} dall'ultima
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lente, un ulteriore ingrandimento di un fattore
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$M' = 300 / (350-250) = 3$.
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A questa distanza l'immagine viene
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rilevata, dopo aver diviso il cammino ottico in due rami con un
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\textit{beam-splitter}, da due sensori CMOS monocromatici
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(Thorlabs DCC1545M).
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La potenza viene suddivisa tra i due sensori secondo il rapporto
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90:10. Il sensore che riceve la frazione maggiore di potenza sarà
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utilizzato per il sistema attivo di stabilizzazione meccanica (descritto
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in sezione \ref{sec:active_stab}), l'altro sensore verrà utilizzato
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per mostrare costantemente su un monitor la situazione del campione.
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\section{Fluorescenza}
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\section{Pinzette ottiche}
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Il fascio \textit{laser} collimato in uscita da una sorgente
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\ce{Nd}:\ce{YVO4} attraversa immediatamente una serie di due isolatori
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ottici, necessari per ridurre al minimo le instabilità della sorgente
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dovute alla retro-riflessione.
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Successivamente, dopo aver attraversato una lamina $\lambda/2$,
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viene diviso in due fasci ortogonali da un cubo polarizzatore.
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I due fasci avranno polarizzazioni parallele o perpendicolari rispetto
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alla superficie del tavolo ottico, e la lamina $\lambda/2$ consente di
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modificare la ripartizione di potenza tra i due rami.
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I due rami vengono ricombinati utilizzando un secondo cubo
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polarizzatore, dopo aver attraversato due modulatori acusto-ottici
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(\textit{Acousto Optic Modulator, AOM}).
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Gli AOM vengono realizzati ponendo un cristallo di diossido
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di tellurio (\ce{TeO2}) in contatto
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con un trasduttore piezoelettrico: la radiofrequenza trasmessa al
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trasduttore consente l'instaurazione di un onda stazionaria acustica
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all'interno del cristallo, che si comporta sostanzialmente come un
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reticolo di diffrazione. Variando l'ampiezza e la frequenza del
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segnale
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elettrico inviato agli AOM è possibile modificare le caratteristiche
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dell'onda acustica stazionaria nel cristallo, e quindi ottenere una
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deflessione e una modulazione del fascio in uscita.
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Gli elementi ottici sono allineati in modo che quanto a entrambi
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gli AOM viene applicata una radiofrequenza di \SI{75}{MHz} i due rami
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incidano perpendicolarmente sull'ultimo cubo polarizzatore e proseguano
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il loro percorso esattamente sovrapposti (linea continua nella
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figura \ref{fig:aom}).
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\begin{figure}[ht]
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\centering
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\includegraphics[width=\linewidth]{images/aom.pdf}
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\caption{Schema per la realizzazione di due pinzette ottiche
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indipendenti.}
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\label{fig:aom}
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\end{figure}
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Una coppia di lenti piano-convesse con distanze focali di
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\SIlist{??;??}{\mm} incrementa la dimensione del fascio e rende il
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piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il piano
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delle uscite degli AOM. In questo modo, per qualsiasi deflessione
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angolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappole
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passeranno sempre collimati per il centro del piano focale posteriore
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dell'obiettivo, con angolo d'incidenza dipendente dalla radiofrequenza
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applicata. I fasci, quindi, attraversano l'obiettivo e vengono
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focalizzati dentro il campione propagandosi parallelamente all'asse
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ottico principale. La variazione di angolo di incidenza nel piano
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focale posteriore dell'obiettivo si tradue in uno spostamento
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orizzontale dei fasci nel piano del campione: in questo modo,
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regolando la radiofrequenza degli AOM è possibile spostare la posizione
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delle trappole lungo una linea orizzontale all'interno del campione.
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I fattori di conversione tra posizione della trappola nel campione e
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frequenza inviata all'AOM, determinati dalle caratteristiche degli AOM
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e dalla geometria del sistema ottico, vengono determinati a posteriori
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visualizzando microsfere intrappolate e creando rette di calibrazione.
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I modulatori acusto-ottici utilizzati (AA Opto-Electronic, DTSXY-250)
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sfruttano onde acustiche di taglio e richiedono una polarizzazione
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in ingresso lineare e perpendicolare all'onda acustica.
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Per questo nel percorso ottico vengono aggiunte due ulteriori
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lamine $\lambda / 2$: una permette di aver per entrambi gli AOM la
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stessa polarizzazione in ingresso, la seconda ruota nuovamente di
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\SI{90}{\degree} la polarizzazione di uno dei due fasci in modo che
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abbiano polarizzazione ortogonali prima di ricombinarsi.
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L'intervallo di scansione angolare consentito da questi AOM è di circa
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\SI{2.8}{\degree}, corrispondenti a variazioni di \SI{50}{\MHz} nella
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radiofrequenza fornita. Lungo questo intervallo l'efficienza dell'AOM,
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ovvero la frazione di fascio deflessa nel primo ordine di diffrazione,
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può variare significativamente. Questo dipendenza può essere nociva
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per gli esperimenti con le pinzette ottiche: se l'intensità
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dei fasci non è uniforme per tutte le posizioni della trappola,
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la rigidità di essa varierà durante gli spostamenti, rendendo
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difficile la manipolazione del campione attraverso lunghe distanze e
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potenzialmente falsando i risultati degli esperimenti.
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Variando l'angolo di incidenza del fascio rispetto all'AOM è possibile
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ottimizzare questa dipendenza intorno a un intervallo di deflessioni
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angolari di nostro interesse. Resta comunque una variazione non
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trascurabile della rigidità delle trappole in funzione della posizione
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e per tenerne conto si utilizza un'apposita procedura di calibrazione
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in cui la rigidità viene misurata osservando la diffusione di una
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microsfera nella trappola, per una griglia equispaziata di punti.
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Per poter osservare e registrare gli spostamenti delle microsfere
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nella trappole così realizzate è stato implementato un sistema
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di rilevamento della radiazione diffusa nel piano focale posteriore
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(\textit{back-focal plane detection}, BFPD).
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Il profilo d'intensità della luce diffusa in avanti da una microsfera
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in una trappola ottica, rilevato nel piano focale posteriore, permette
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di conoscere la posizione relativa della microsfera rispetto al centro
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della trappola, senza dipendere (in condizioni ideali) dalla posizione
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assoluta della trappola nel campione.
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Per sfruttare questa proprietà la radiazione a \SI{1064}{\nm} è
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estratta dal cammino ottico successivo al condensatore grazie ad uno
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specchio dicroico. Successivamente le due polarizzazioni,
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corrispondenti alle due trappole, vengono separate da un cubo
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polarizzatore, e inviate rispettivamente a due fotodiodi a quadranti
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(\textit{Quadrant Photodiode Detector, QPD}), posizionati in un piano
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coniugato con il piano focale posteriore del condensatore.
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In questo piano la distribuzione spaziale del campo elettrico è data
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dalla trasformata di Fourier del campo in corrispondenza del piano
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del campione messo a fuoco. È possibile dimostrare che nel caso di
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una sfera spostata rispetto al centro della trappola l'asimmetria del
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profilo d'intensità nel piano focale posteriore sarà direttamente
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proporzionale allo spostamento della sfera rispetto al centro
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della trappola. Grazie ai due QPD possiamo quindi qu
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\section{Force-clamp}
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In figura \ref{fig:setup} è mostrato uno schema integrale
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dell'apparato realizzato.
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Le componenti principali sono descritte nella sezione \ref{sec:setup}.
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Successivamente, nella sezione \ref{sec:stabilization} è descritto il
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sistema di stabilizzazione meccanica introdotto per compensare lo
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spostamento
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del campione dovuto a deriva termica e oscillazioni acustiche.
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Nella sezione \ref{sec:calibration} è descritta nel dettaglio la
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procedura usata per la calibrazione dei parametri delle trappole
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ottiche.
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L'esperimento tipico utilizzato per studiare l'interazione tra una
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proteina e un microfilamento di actina consiste in un saggio a tre
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sfere, o \textit{3-beads assay}. I dettagli per la realizzazione di
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questo esperimento sono illustrati nella sezione \ref{sec:3beads}.
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\section{Apparato sperimentale}
|
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\label{sec:setup}
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L'apparato sperimentale è stato realizzato presso i laboratori del
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LENS, sulla base dell'apparato utilizzato in precedenza dal di
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Biofisica di Singola Molecola per lo studio delle interazioni tra
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miosina e filamenti di actina e repressori della trascrizione
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e filamenti di DNA.
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L'apparto si compone di N parti principali:
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\begin{description}
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\item[Pinzette ottiche:] Una coppia di fasci gaussiani a \SI{1064}{\nm}, ottenuti da un laser a stato solido,
|
|
\end{description}
|
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\begin{sidewaysfigure}
|
|
\includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/Setup.pdf}
|
|
\caption{Caption}
|
|
\label{fig:setup}
|
|
\end{sidewaysfigure}
|
|
|
|
\begin{sidewaystable}
|
|
\centering
|
|
\begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l}
|
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\toprule
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Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\
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\midrule
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\multicolumn{5}{l}{\it Fluorescence Excitation Path}\\
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F-Clean635
|
|
& Bandpass Filter
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|
& \SI{635}{\nm} laser clean-up
|
|
& $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm},
|
|
bw: \SI{14}{\nm}$
|
|
& FF01-640/14-25\\
|
|
L-TS1a
|
|
& Plano-Convex Spherical Lens
|
|
& Telescope for \SI{635}{\nm} laser
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS1b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS2a
|
|
&
|
|
& Telescope for \SI{488}{\nm} laser
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS2b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
DIC-532
|
|
& Single-edge Dichroic Filter
|
|
& Excitation beam multiplexing
|
|
& $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$
|
|
& Di02-R532-25-D\\
|
|
DIC-488
|
|
& &
|
|
& $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$
|
|
& Di02-R488-25-D\\
|
|
L-TS3a
|
|
& Achromatic Doublet
|
|
& Telescope for comb. ex. lasers
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS3b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-Exc
|
|
&
|
|
& Excitation beam focusing
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
DIC-Fluor
|
|
& Quad-edge Dichroic Filter
|
|
& Excitation/Emission separation
|
|
& $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$
|
|
& Di03-R405/488/532/635-t1 \\
|
|
\multicolumn{5}{l}{\it Tweezers Path}\\
|
|
L-TS4a
|
|
& Plano-Convex Spherical Lens
|
|
& Telescope matching isolator size
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS4b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS5a
|
|
& Plano-Convex Spherical Lens
|
|
& Telescope after isolator
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-TS5b
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-Twz1
|
|
& Plano-Convex Spherical Lens
|
|
& Telescope after isolator
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-Twz2
|
|
& &
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
DIC-Twz1
|
|
& Single-edge Dichroic Filter
|
|
& Tweezer beam insertion
|
|
& $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$
|
|
& \\
|
|
\multicolumn{5}{l}{\it Imaging Path}\\
|
|
L-Im1
|
|
& Tube Lens
|
|
& Tube Lens
|
|
& f: \SI{0}{\mm}
|
|
& \\
|
|
L-Im2
|
|
& Imaging Lens
|
|
& Imaging Lens
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& f: \SI{0}{\mm}
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& \\
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DIC-BF
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& Single-edge Dichroic Filter
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& Fluorescence/Brightfield demux
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& $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$
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& FF705-Di01-25x36\\
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F-BlockBF
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& Shortpass Filter
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& Residual brightfield suppression
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& $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$
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& FESH0700\\
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F-Emiss
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& Quad-band bandpass Filter
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& Fluorophore emission filtering
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& $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$
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& FF01-446/510/581/703\\
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F-BlockTwz
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& Bandstop filter
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& Fluorophore emission filtering
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& $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$
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& FF01-446/510/581/703\\
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\end{tabular}
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\caption{Caption}
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\label{tab:my_label}
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\end{sidewaystable}
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\section{Stabilizzazione meccanica}
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\label{sec:stabilization}
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