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\chapter{Metodi}
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\label{cap:methods}
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%%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%%
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\section{Stabilizzazione meccanica}
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\label{sec:stabilization}
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Nonostante l'isolamento meccanico fornito dagli elastomeri e dal
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tavolo ottico la posizione del campione rispetto al centro
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dell'obiettivo e la quota del piano focale sono soggette a
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fluttuazioni e derive.
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Gli effetti più evidenti e rilevabili sono rapide oscillazioni della
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posizione del campione dovute a vibrazioni acustiche residue e una
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progressive deriva rispetto alla posizione fissata che diventa
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significativa ($> \SI{100}{\nm}$) per tempi di osservazione di
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diversi minuti.
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Per quantificare quest'effetto viene usato un apposito campione in cui
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diverse microsfere in silice, di diametro \SI{0.5}{\um}, vengono
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immobilizzate in uno strato di nitrocellulosa depositato nella
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superficie interna del vetrino coprioggetti.
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Le varie fasi per la preparazione di questo campione sono descritte
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nei particolari nell'appendice \ref{app:protocols}, protocollo
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\ref{proto:silica_beads_flow_cell}.
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Le microsfere immobilizzate nel campione possono essere messe a fuoco
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e visualizzate attraverso il sistema di microscopia a luce trasmessa.
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Una volta selezionata e messa a fuoco una microsfera, analizzando
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l'immagine prodotta da uno dei due sensori CMOS è possibile calcolare
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le coordinate (in pixel) del suo centroide:
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\begin{equation}
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(x_{cen}, y_{cen}) =
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\frac{
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\sum_{(x, y)} (x, y) I(x, y)
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}{
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\sum_{(x, y)} I(x, y)
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}
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\end{equation}
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Per evitare di considerare altre microsfere o imperfezioni sul campione
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si sceglie di effettuare il calcolo del centroide limitando la regione
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dell'immagine utilizzata a un rettangolo nel quale una microsfera è
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sufficientemente isolata.
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Ricalcolando il centroide intervalli temporali fissati è possibile
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osservare la deriva della posizione (x, y) della microsfera.
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Inoltre è possibile sfruttare questo stesso campione per effettuare
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una calibrazione del fattore di conversione pixel/nm lungo due assi
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ortogonali.
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Per effettuare la calibrazione, dopo aver calcolato il centroide
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della microsfera, si sposta la posizione dal campione lungo uno dei
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due assi di una distanza ben definita, utilizzando il traslatore
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piezoelettrico. A questo punto, calcolando la nuova posizione del
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centroide si ottiene il rapporto tra lo spostamento comandato al
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traslatore (in \si{\nm}) e la variazione del centroide (in pixel).
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Ripetendo questa operazione in sequenza per vari punti si ottiene
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una curva di calibrazione per l'asse scansionata, dalla quale è
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possibile estratte la costante di proporzionalità con un \textit{fit}
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lineare.
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Risulta più complesso invece stimare la deriva del piano focale:
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per questo motivo è stato sviluppato un metodo per determinare a
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partire dalle immagini un valore che sia linearmente proporzionale
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alla quota del piano focale rispetto al centro della sfera.
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Il metodo sviluppato sfrutta le caratteristiche dalla distribuzione
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radiale della luce diffusa dalla microsfera.
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In figura \ref{fig:radial_itensity} rappresentato l'andamento del
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profilo radiale variando la quota del piano focale (z).
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\begin{figure}[ht]
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\centering
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\includegraphics{images/radial_intensity.pdf}
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\caption{Profilo di indensità radiale rispetto al centroide
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per una microsfera, in diversi piani }
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\label{fig:radial_itensity}
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\end{figure}
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Da questi dati è stato possibile osservare che il rapporto tra
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l'intensità integrata in un anello centrato sulla microsfera e quella
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integrata nella regione interna al medesimo anello (regioni gialle
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e arancioni in figura), mostra un andamento proporzionale alla quota
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del piano focale, almeno in un certo intorno del centro della sfera.
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In figura \ref{fig:z_est} viene mostrato l'andamento del rapporto
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tra l'intensità media in un anello con raggio interno ed esterno
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rispettivamente di \SIlist{80;160}{pixel} e l'intensità media
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calcolata in un raggio di \SI{60}{pixel}.
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\begin{figure}[ht]
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\centering
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\includegraphics[scale=0.8]{images/z-est.pdf}
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\caption{Andamento del rapporto intensità anello/cerchio in
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funzione della quota del piano focale.}
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\label{fig:z_est}
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\end{figure}
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Come si può osservare la quantità così definita può essere usata
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per determinare la quota con una discreta sensibilità in
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un intervallo di \SIrange{3}{4}{\um} intorno al centro della sfera.
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Analogamente a quanto fatto per le assi x e y è possibile eseguire
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una calibrazione spostando il campione di una quota controllata
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attraverso il traslatore piezoelettrico dell'obiettivo, e costruire
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una curva di calibrazione come quella in figura \ref{fig:z_est}.
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Conoscendo quindi tre fattori di calibrazione è possibile, partendo
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da un'immagine della microsfera, ottenere una stima della sua
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posizione nello spazio tridimensionale. Questo fatto ci permette
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di implementare un sistema attivo di stabilizzazione meccanica del
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microscopio. Continuando a monitorare la sfera mediante mentre si
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eseguono le misurazioni di forza è possibile rilevare gli spostamenti
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del campione e compensarli inviando appositi comandi ai traslatori
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piezoelettrici.
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In ambiente LabVIEW è stato sviluppato un codice di controllo
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che implementa un meccanismo di retroazione tra le letture sulla
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posizione della sfera e i traslatori piezoelettrici.
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Il codice consente all'operatore di selezionare la regione
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d'interesse intorno a una microsfera immobilizzata sul vetrino
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coprioggetti. Successivamente, quando la stabilizzazione viene
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attivata, il codice acquisice diverse immagini della microsfera e
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ne stima la posizione iniziale in termini di coordinate (x, y, z),
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usando i fattori di conversione determinati con la calibrazione.
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A questo punto viene avviato un ciclo di retroazione: continuando
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a acquisire immagini della microsfera (a una frequenza che può
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arrivare fino a \SI{100}{\Hz}), viene comandato ai traslatori
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uno spostamento proporzionale alla differenza tra la posizione della
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sfera rilevata e quella iniziale.
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Quando il sistema di stabilizzazione meccanica viene attivato
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è stato possibile mostrare che la posizione media del campione resta
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stabile indipendentemente dal tempo di osservazione, con fluttuazione
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che hanno una deviazione standard di circa \SI{1}{\nm}.
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Introdurre nel ciclo di controlla alla componente proporzionale
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una componente integrale o derivativa non altera significativamente
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la stabilizzazione raggiunta.
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Il fattore di proporzionalità del ciclo di retroazione
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(guadagno, $g$) influenza
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le caratteristiche della risposta del sistema: un fattore troppo
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elevato causerà una sovracorrezione delle perturbazioni, inducendo
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oscillazioni smorzate, mentre un fattore troppo piccolo aumenterà
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inutilmente il tempo di risposta. Per trovare il valore ottimale
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si osserva la risposta del sistema per diversi valori di $g$, in
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seguito ad una perturbazione fittizia ottenuta modificando di
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\SI{50}{\nm} il \textit{set point} lungo una direzione.
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In figura \ref{fig:step_response} si riporta la risposta del
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sistema di stabilizzazione per gli assi $x$ e $z$ a diversi valori
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del fattore di proporzionalità $g$.
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\begin{figure}
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\centering
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\includegraphics{images/step_response.pdf}
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\caption{Risposta del sistema a una perturbazione di \SI{50}{\nm}
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lungo l'asse $x$ (sinistra) e $z$ (destra).}
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\label{fig:step_response}
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\end{figure}
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L'acquisizione di diverse tracce della durata di 5-10 minuti ha
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sempre mostrato deviazioni standard delle fluttuazioni comprese
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tra \SIlist{1;2}{\nm}.
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In figura \ref{fig:active_stab} vengono riporati i tracciati delle
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fluttuazioni della posizione del campione, con (nero) e senza
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(rosso) l'intervendo del sistema di stabilizzazione attiva.
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\begin{figure}[ht]
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\centering
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\includegraphics{images/active_stab.pdf}
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\caption{Deriva della posizione del campione con e senza sistema di
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stabilizzazione attivato.}
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\label{fig:active_stab}
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\end{figure}
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\section{Calibrazione parametri trappole}
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\label{sec:calibration}
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Per poter eseguire misurazioni di forza su sistemi biologici è
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fondamentale riuscire a conoscere il valore della tensione applicata
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alle microsfere intrappolate nelle pinzette ottiche. Questo è
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possibile dal momento che l'azione di una pinzetta ottica su una
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microsfera può essere modellizzata come una forza di richiamo
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elastica (vedi sezione \ref{sec:ot}).
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Conoscendo la costante di richiamo è possibile mettere in relazione
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la posizione della sfera rispetto al centro della trappola
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(rilevabile tramite i QPD) con la risultante delle altre forze
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esterne che agiscono sulla microsfera.
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Quando la microsfera viene messa in movimento da una forza esterna,
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è necessario considerare anche l'attrito viscoso con
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il fluido in cui è immersa. La forza dovuto all'attrito viscoso
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avrà la forma:
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\begin{equation}
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\vec{F}_{visc} = - \gamma \vec{v}\
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\end{equation}
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Dove $\gamma$ è il coefficiente di attrito idrodinamico della
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microsfera.
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Nel caso più generele la microsfera sarà inoltre soggetta a una
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sforza stocastica ($\eta(t)$), dovuta agli urti con il fluido, e
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a una forza esterna $\vec{F}$, ad esempio dovuta alle tensione di una
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biomolecola legata ad essa.
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Possiamo quindi scrivere la forma più generale dell'equazione di moto
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come:
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\begin{equation}
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\label{eq:bead_motion}
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\underbrace{m \ddot{\vec{x}}}_\text{inerzia} =
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\underbrace{\vec{F}}_\text{f. esterna}
|
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+ \underbrace{\mathbf{\eta}(t)}_\text{f. stoc.}
|
|
- \underbrace{\gamma \dot{\vec{x}}}_\text{attrito}
|
|
- \underbrace{k \vec{x}}_\text{richiamo}
|
|
\end{equation}
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La forza stocastica $\eta(t)$ ha media nulla
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($\langle\eta(t)\rangle_t = 0$)
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e viene assunta con distribuzione di probabilità gaussiana con
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$\sigma^2 = 2 k_B T \gamma$.
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In condizioni di equilibrio la posizione media della microsfera
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sarà quindi:
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\begin{equation}
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\vec{x_0} = \langle \vec{x(t)} \rangle_t = - \frac{\vec{F}}{k}
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\end{equation}
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E la deviazione standard delle fluttuazioni rispetto alla posizione
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di equilibrio può essere determinata usando il teorema di
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equipartizione dell'energia:
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\begin{multline}
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\langle U(x) \rangle = \frac{1}{2} k \langle (x-x_0)^2 \rangle
|
|
= \frac{1}{2} k_B T
|
|
\\ \Longrightarrow
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|
\langle (x-x_0)^2 \rangle
|
|
= \langle x^2 \rangle - \langle x \rangle^2
|
|
= \sigma_x^2 = k_B T / k
|
|
\end{multline}
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Oltre alla conoscenza di $k$ un altro valore importante da stimare
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è il tempo di rilassamento $\tau$ del sistema, ovvero la scala
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temporale nella quale la microsfera si stabilizza nella nuova
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posizione di equilibrio a seguito di una variazione della forza $F$.
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Questo tempo è strettamente legato allo smorzamento dovuto all'attrito
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idrodinamico.
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Osservando l'equazione di moto \ref{eq:bead_motion} si può
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descrivere la dinamica della sfera in due regimi estremi:
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\begin{itemize}
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\item il regime \textit{balistico}, quando il moto è dominato dalla componente inerziale, con un tempo caratteristico
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di rilassamento $\tau_\text{bal} = m / \gamma$.
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\item il regime \textit{diffusivo}, qunado il termine inerziale
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legato alla massa è trascurabile, con un tempo di rilasamento
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$\tau_\text{diff} = \gamma / k$.
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\end{itemize}
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Tenendo conto delle caratteristiche delle microsfere
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si hanno valori $\tau_\text{bal} < \SI{1}{\us}$, mentre
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per i valori di $k$ ottenibili con il nostro sistema di pinzette
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ottiche è possibile ridurre $\tau_\text{diff}$ fino a circa
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\SI{100}{\us}.
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Il tempo di risposta del sistema nel regime balistico è quindi
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completamente trascurabile, e il transiente tra una perturbazione
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e la stabilizzazione nella nuova posizione di equilibrio può
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essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto.
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Il protocollo di calibrazione sviluppato consente, partendo
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dalle tracce temporali della posizione relativa della
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microsfera un'asse spaziale, di determinare con precisione i
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valori di $\tau$, e quindi di $k$ per ogni posizione della
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trappola.
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Per fare questo si tiene contro che la densità spettrale
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delle fluttuazioni di posizione è data da \cite{Gittes1998}:
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\begin{equation}
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S_x(\nu) = \frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)}
|
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\end{equation}
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Dove $\nu_c = 1 / (2\pi\tau) = k / 2\pi\gamma$ é
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la frequenza di taglio, inversamente proporzionale al tempo
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di rilassamento.
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Da un semplice $fit$ della distribuzione spettrale di rumore
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della posizione è possibile quindi estrarre il valore di k.
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Il segnale misurabile in uscita dagli amplificatori differenziali dei QPD è un segnale in tensione,
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compreso tra \SIlist{-10;+10}{\V}, proporzionale alla
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posizione relativa della microsfera.
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Tramite il fit dei dati possiamo anche ottenere il fattore
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di conversione $\beta$ tale che $x_{rel}(V) = \beta V$.
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La distribuzione spettrale di rumore, riscalata rispetto alla
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variabile $V$ sarà quindi:
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\begin{equation}
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S_V(\nu) = \frac{1}{\beta^2}\frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)}
|
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\end{equation}
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Per la calibrazione si procede a preparare un campione con una
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cella di flusso contenente microsfere di polistirene (di diametro
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\SI{0.9}{\um}).
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Grazie a un'apposito programma sviluppato in ambiente LabVIEW
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(\texttt{Force-Clamp Calibration}) è possibile acquisire in maniera
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automatizzata le tracce del segnale prodotto dai QPD per una griglia
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di posizioni delle trappole. Il codice si occupo di memorizzare
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le tracce temporali per ogni posizione spostare la trappola modificando
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la frequenza inviata agli AOM.
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Le tracce temporali vengono acquisite per una durata di \SI{10}{\second} per ogni
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posizione e una frequenza di campionamento di \SI{200}{kS/s}.
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In seguito viene calcolata per ogni posizione di ciascuna
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trappola la distribuzione spettrale di rumore, utilizzando un algoritmo
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per la trasformata di Fourier veloce (\textit{Fast Fourier Transform}, FFT),
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con i seguenti parametri riportati in tabella \ref{tab:fft_par}.
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\begin{table}[ht]
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\centering
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\begin{tabular}{>{\bf}l l}
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\toprule
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Metodo di accumulo & Welch\cite{Welch1967} \\
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Segmenti accumulati & 32 \\
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Lunghezza segmenti & N/32 \\
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Finestra & Hann \\
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\bottomrule
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\end{tabular}
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\caption{Parametri FFT}
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\label{tab:fft_par}
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\end{table}
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Su ciascuno spettro viene eseguito un \textit{fit} per determinare
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i valori di $\beta$ e $k$ imponendo i valori noti riportati in tabella \ref{tab:fit}.
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\begin{table}[ht]
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\centering
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\begin{tabular}{l l l}
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|
\toprule
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Parametro & Simbolo & Valore \\
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\midrule
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Raggio della sfera & $R$ & \SI{450}{\nm} \\
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Temperatura & $T$ & \SI{295}{\K} \\
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Distanza sfera da superificie & $d$ & \SI{1}{\um} \\
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Viscosità & $\eta$ & \SI{1e-3}{Pl} \\
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Coefficiente attrido idrodinamico & $\gamma$ & $6 \pi \eta R \left(1+\frac{9R}{16d}\right)$\\
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|
Frequenza minima & $\nu_\text{min}$ & \SI{15}{\Hz} \\
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|
Frequenza massima & $\nu_\text{max}$ & \SI{50}{\kHz} \\
|
|
\bottomrule
|
|
\end{tabular}
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|
\caption{Parametri $fit$ distribuzione spettrale}
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\label{tab:fit}
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|
\end{table}
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In figura \ref{fig:psd} si riporta una distribuzione spettrale tipica
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confrontata con la funzione teorica.
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\begin{figure}[htpb]
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\centering
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\includegraphics{images/PSD.pdf}
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\caption[scale=0.7]{Densità spettrale di rumore per la posizione di una trappola
|
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ottica.}
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\label{fig:psd}
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\end{figure}
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Dai valori di $k$ e $\beta$ estratti per tutte le posizioni di ciascuna
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trappola è possibile interpolare i valori per ogni possibile posizione
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intermeda. Per fare questo si usano delle funzioni polinomiali di ordine 3,
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come mostrato in figura \ref{fig:trap_ccurves}.
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\begin{figure}[htpb]
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|
\centering
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|
\includegraphics[scale=0.8]{images/calibration_curves.pdf}
|
|
\caption{Andamento e interpolazione dei valori di $k$ e $\beta$.}
|
|
\label{fig:trap_ccurves}
|
|
\end{figure}
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\section{\textit{Force-clamp} tramite ciclo di retroazione}
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\label{sec:force-clamp}
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Un esperimento di \textit{force-clamp} consiste nello studiare la
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dinamica e della formazione e della rottura del legame tra due
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molecole quando queste sono sottoposte a una determinata
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forza di trazione costante.
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Per poter applicare una tale forza attraverso una microsfera catturata
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in una pinzetta ottica è stato implementato un sistema di retroazione
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tra la lettura della posizione relativa della microsfera nella
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trappola (dai QPD) e la posizione della trappola nel campione (tramite
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gli AOM).
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Scelto un valore per la forza (F) si può ricavare, conoscendo il
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valore di $k$, il corrispondente spostamento $\Delta x$ rispetto al
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centro della trappola.
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Comandando agli AOM uno spostamento della trappola proporzionale
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alla differenza tra la posizione relativa attuale della microsfera
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nella e quella necessaria per ottenere la forza $F$ possono
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verificarsi due situazioni:
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\begin{itemize}
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\item Nel caso in cui la microsfera sia libera in soluzione,
|
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ovvero non vi sia applicata alcuna forza esterna, essa tenderà
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a muoversi sempre verso il centro della trappola (la sua posizione
|
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di equilibrio). Il sistema di retroazione quindi, per mantenere
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la sfera in un punto di non equilibrio a distanza $\Delta x$ dalla
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posizione di riposo dovrà continuare a muovere indefinitamente
|
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la posizione della trappola nella stessa direzione.
|
|
\item Nel caso in cui la microsfera si leghi a delle molecole
|
|
immobilizzate sulla superficie del campione, lo spostamento delle
|
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trappola si arresterà quando la forza esterna esercitata sulla
|
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microsfera, dovuta al legame, sarà tale da mantere $\Delta x$
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al valore fissato. In questo modo, alle due molecole legate,
|
|
sarà applicata una tensione pari a quella selezionata.
|
|
\end{itemize}
|
|
|
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\begin{figure}[ht]
|
|
\centering
|
|
\includegraphics{images/tension.pdf}
|
|
\caption{\textit{Force-clamp} con una trappola.}
|
|
\label{fig:tension}
|
|
\end{figure}
|
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Osservando i tracciati temporali della posizione relativa della
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microsfera è possibile individuare la transizione tra questi due
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regimi, sia attraverso la velocità di variazione della posizione,
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che possiamo ottenere derivando numericamente il segnale, sia dalla
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variazione della deviazione standard delle fluttuazioni e del loro
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spettro di rumore. Tramite un'analisi statistica di questi dati
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per diversi valori di tensione selezionati è possibile caratterizzare
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quantitativamente la dipendenza dalle sollecitazioni esterne del
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legame analizzato.
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Per realizzare sperimentalmente questa misura occorre un sistema
|
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elettronico in grado di campionare il segnale prodotto dai QPD e
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modificare di conseguenza la frequenza del segnale di modulazione invato
|
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agli AOM.
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Per garantire un funzionamento stabile e la possibilità
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di rilevare eventi di durata confrontabile con il tempo di rilassamento
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diffusivo si utilizza una scheda elettronica programmabile dedicata,
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di tipo FPGA (\textit{Field Programmable Gate Array}), per controllare
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il ciclo di retroazione.
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In questo modo è possibile raggiungere una frequenz
|
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\section{Saggio a tre sfere}
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\label{sec:three-beads}
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Visto che nelle giunzioni aderenti la trasmissione degli sforzi
|
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meccanici è spesso media tra proteine filamentose (come la
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\textit{F-actina}) risulta particolarmente utile sviluppare un
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saggio in cui, usando due trappole, è possibile mettere in tensione
|
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una proteina filamentosa, simulando ad esempio lo stato in cui si
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può trovare la \textit{F-actina} nel citoscheletro.
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\begin{figure}[h]
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\centering
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\begin{subfigure}{0.45\linewidth}
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\centering
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\includegraphics[width=\linewidth]{images/three_beads_tension.pdf}
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\caption{}
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\label{fig:feedback-off}
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\end{subfigure}
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\\[\baselineskip]
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\begin{subfigure}{0.45\linewidth}
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\centering
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\includegraphics[width=\linewidth]{images/three_beads_fbON_unbound.pdf}
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\caption{}
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\label{fig:feedback-on-unbound}
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\end{subfigure}
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\hfill
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\begin{subfigure}[H]{0.45\linewidth}
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\centering
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\includegraphics[width=\linewidth]{images/three_beads_fbON_bound.pdf}
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\caption{}
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\label{fig:feedback-on-bound}
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\end{subfigure}
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\centering
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\caption{(a) Ciclo di retroazione disattivato, microsfere in posizione di equilibrio. La tensione del filamento può essere aggiustata modificando la distanza delle trappole. (b) Ciclo di retroazione
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attivato, nessuna molecola immobilizzata legata al filamento. Le
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trappole si muovono indefinitamente per ``inseguire'' la posizione
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corrispondente alla forza richiesta. (c) Il filamento si lega con
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una molecola immobilizzata sul vetrino, la microsfera raggiunge la
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posizione target e lo spostamento delle trappole si arresta. La forza
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applicata sul legame è pari a quella selezionata}.
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\label{fig:three_beads}
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\end{figure}
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In figura \ref{fig:three_beads} è rappresentato lo schema realizzato
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\section{Fluorescenza di singola molecole}
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\label{sec:single_molecule_fluorescence}
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\section{TIRF e illuminazione a modi di galleria}
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\label{sec:gallery_mode}
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