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\chapter{Metodi}
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\label{cap:methods}
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\section{Stabilizzazione meccanica}
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\label{sec:stabilization}
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Nonostante l'isolamento meccanico fornito dagli elastomeri e dal
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tavolo ottico la posizione del campione rispetto al centro
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dell'obiettivo e la quota del piano focale sono soggette a
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fluttuazioni e derive.
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Gli effetti più evidenti e rilevabili sono rapide oscillazioni della
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posizione del campione dovute a vibrazioni acustiche residue e una
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progressive deriva rispetto alla posizione fissata che diventa
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significativa ($> \SI{100}{\nm}$) per tempi di osservazione di
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diversi minuti.
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Per quantificare quest'effetto viene usato un apposito campione in cui
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diverse microsfere in silice, di diametro \SI{0.5}{\um}, vengono
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immobilizzate in uno strato di nitrocellulosa depositato nella
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superficie interna del vetrino coprioggetti.
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Le varie fasi per la preparazione di questo campione sono descritte
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nei particolari nell'appendice \ref{app:protocols}, protocollo
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\ref{proto:silica_beads_flow_cell}.
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Le microsfere immobilizzate nel campione possono essere messe a fuoco
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e visualizzate attraverso il sistema di microscopia a luce trasmessa.
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Una volta selezionata e messa a fuoco una microsfera, analizzando
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l'immagine prodotta da uno dei due sensori CMOS è possibile calcolare
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le coordinate (in pixel) del suo centroide:
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\begin{equation}
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(x_{cen}, y_{cen}) =
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\frac{
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\sum_{(x, y)} (x, y) I(x, y)
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}{
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\sum_{(x, y)} I(x, y)
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}
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\end{equation}
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Per evitare di considerare altre microsfere o imperfezioni sul campione
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si sceglie di effettuare il calcolo del centroide limitando la regione
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dell'immagine utilizzata a un rettangolo nel quale una microsfera è
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sufficientemente isolata.
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Ricalcolando il centroide intervalli temporali fissati è possibile
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osservare la deriva della posizione (x, y) della microsfera.
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Inoltre è possibile sfruttare questo stesso campione per effettuare
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una calibrazione del fattore di conversione pixel/nm lungo due assi
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ortogonali.
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Per effettuare la calibrazione, dopo aver calcolato il centroide
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della microsfera, si sposta la posizione dal campione lungo uno dei
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due assi di una distanza ben definita, utilizzando il traslatore
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piezoelettrico. A questo punto, calcolando la nuova posizione del
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centroide si ottiene il rapporto tra lo spostamento comandato al
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traslatore (in \si{\nm}) e la variazione del centroide (in pixel).
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Ripetendo questa operazione in sequenza per vari punti si ottiene
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una curva di calibrazione per l'asse scansionata, dalla quale è
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possibile estratte la costante di proporzionalità con un \textit{fit}
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lineare.
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Risulta più complesso invece stimare la deriva del piano focale:
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per questo motivo è stato sviluppato
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\section{Calibrazione parametri trappole}
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\label{sec:calibration}
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\section{Retroazione AOM e \textit{force-clamp}}
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\label{sec:force-clamp}
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\section{Saggio a tre sfere}
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\label{sec:three-beads}
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\section{Fluorescenza di singola molecole}
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\label{sec:single_molecule_fluorescence}
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\section{TIRF e illuminazione a modi di galleria}
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\label{sec:gallery_mode}
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