%%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% \chapter{Apparato sperimentale} \label{cap:setup} L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopio invertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanica del LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistema di due pinzette ottiche posizionabili elettronicamente e con uno schema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungere la sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemi di illuminazione (campo largo, TIRF, HILO). Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura \ref{fig:microscope}. %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e il funzionamento simultaneo - senza interferenze - dei tre principali schemi di microscopia e manipolazione: \begin{description} \item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una sorgente LED a spettro largo viene collimata da un condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso il campione. L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita del contrasto di densità dello stesso. \item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo, quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono essere usati per intrappolare e manipolare microsfere in soluzione. La radiazione laser diffusa che attraversa il campione e viene raccolta dal condensatore può essere analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo spostamento dal centro delle sfere intrappolate. \item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio di eccitazione. \end{description} \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf} \caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.} \label{fig:microscope} \end{figure} Per evitare interferenze tra i tre schemi è stato necessario scegliere opportune lunghezze d'onda per la radiazione di illuminazione e, di conseguenza, appropriati specchi dicroici e filtri. L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando una sorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm}, le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un laser a stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per la microscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgenti laser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} e l'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccolta e disaccopiata dall'illuminazione a luce trasmessa. \section{Microscopio e traslatori} Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituiscono il microscopio sono assemblati su una struttura metallica personalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS. Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattro elastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuare significativamente le vibrazioni meccaniche. Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimento attraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa. Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarie per gli esperimenti viene caricata in una camera di reazione realizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti). Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraverso quattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore corto raggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il \textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}. Per gli scopi di questa tesi sono stati usati due obiettivi differenti: \begin{itemize} \item Un obiettivo planapocromatico 60x a immersione ad acqua, con alta apertura numerica ($NA = 1.22$) e distanza di lavoro di \SI{0.2}{\mm} (Nikon) \item Un obiettivo TIRF (??) a immersione a olio (Nikon) \end{itemize} Il primo obiettivo presenta le caratteristiche migliori per quanto riguarda l'efficienza delle pinzette ottiche, anche a profondità significative all'interno del campione. Il secondo obiettivo invece permette la realizzazione di schemi di illuminazione TIRF, al prezzo di un'efficienza delle pinzette ottiche che decresce rapidamente all'aumentare del volume di campione attraversato. La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico può essere modificata attraverso due traslatori controllati elettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, ??) per spostamenti veloci e con risoluzione nanometrica, con una corsa di \SI{100}{\um} per asse, e uno di tipo motore passo-passo (Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI{50}{\mm} per asse. Il piano focale può essere modificato variando la posizione dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico (Physik Instrumente, PIFOC™ ??) con con una corsa di \SI{400}{\um} e risoluzione nanometrica. Il microscopio è stato progettato in modo che al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenza della superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campione preparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti). I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivo sono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente ?? e ??) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in modalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungo raggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito da Galil Motion Control e equipaggiati di un \textit{encoder} che permette la selezione e il monitoraggio della velocità di spostamento. Le tre unità di controllo sono connesse ad un PC mediante interfaccia seriale RS232 e possono essere programmate e controllate usando i protocolli di comunicazione GCS per i moduli Physik Instrumente e GC \cite{gclib} per il modulo Galil Motion Control. Per semplificare l'utilizzo dei tre gli attuatori durante la manipolazione di un campione è stato sviluppato un software in ambiente LabVIEW che implementa i protocolli di comunicazione richiesti. In particolare il software sviluppato consente di utilizzare levette analogiche e cursori di un \textit{controller} della console Xbox 360 (Microsoft) per inviare comandi agli attuatori, rendendo la manipolazione del campione particolarmente semplice e intuitiva. \section{Illuminazione a luce trasmessa} La radiazione emessa da un LED ad alta intensità (Thorlabs, M780L3) con picco di emissione centrato nell'infrarosso, a \SI{780}{nm}, viene filtrata con un filtro passa-basso (Thorlabs, FEHL0750) in modo da sopprimere l'emissione a lunghezze d'onda inferiori a \SI{750}{nm} che andrebbe a interferire con il rilevamento della fluorescenza. Successivamente, con l'ausilio di una singola lente e un accoppiatore in fibra (Thorlabs), la radiazione emessa dal LED e filtrata viene immessa in una fibra ottica e trasportata in corrispondenza del microscopio. All'altra estremità della fibra un sistema formato da un collimatore, un diaframma e una lente aggiusta le dimensioni e la divergenza del fascio di illuminazione, direzionandolo collimato verso il piano focale posteriore del condensatore. Il fascio di illuminazione viene quindi focalizzato sul campione, lo attraversa e la radiazione trasmessa e diffusa viene raccolta dall'obiettivo. Gli obiettivi usati sono corretti all'infinito, questo significa che i raggi in uscita dall'obiettivo sono collimati. Inserendo nel percorso ottico una \textit{lente di tubo} l'immagine viene messa a fuoco in un piano ben preciso. La distanza focale dell'obiettivo è di \SI{3.3}{\mm}, quella della lente di tubo di \SI{250}{\mm}. Otteniamo quindi la formazione di un immagine del piano del campione selezionato a una distanza di \SI{250}{\mm} dalla lente e con un fattore di ingrandimento $M = 250/3.3 \approx 75$. Questa immagine viene ulteriormente ingrandita mediante l'uso di un'ulteriore lente con distanza focale \SI{75}{\mm} posta a \SI{350}{mm} dalla lente di tubo. In questo modo si ottiene, a una distanza di \SI{30}{\cm} dall'ultima lente, un ulteriore ingrandimento di un fattore $M' = 300 / (350-250) = 3$. A questa distanza l'immagine viene rilevata, dopo aver diviso il cammino ottico in due rami con un \textit{beam-splitter}, da due sensori CMOS monocromatici (Thorlabs DCC1545M). La potenza viene suddivisa tra i due sensori secondo il rapporto 90:10. Il sensore che riceve la frazione maggiore di potenza sarà utilizzato per il sistema attivo di stabilizzazione meccanica (descritto in sezione \ref{sec:stabilization}), l'altro sensore verrà utilizzato per mostrare costantemente su un monitor la situazione del campione. I sensori CMOS usati hanno una risoluzione di \SI{1280x1024}{pixel} e un'area attiva di \SI{6.66x5.32}{\mm}, corrispondenti a una dimensione di \SI{5.2x5.2}{\um} per ogni pixel. La massima risoluzione temporale per acquisire un'immagine completa è di \SI{30}{fps}, ma è possibile ottenere risoluzioni più elevate riducendo la dimensione della regione d'interesse. Tenendo conto del fattore complessivo di ingrandimento ($75\times 3 = 225$) un'immagine completa corrisponde a una regione del campione \SI{30x24}{\um}, la dimensione di un singolo pixel corrisponde invece ad un quadrato di lato \SI{23}{\nm} sul campione. I valori corretti possono essere determinati solo sperimentalmente dopo aver fissato l'allineamento del percorso ottico e delle telecamere. Per ottenere i fattori reali di conversione tra pixel e dimensioni sul campione è stato sviluppato un programma in ampiente LabVIEW che, sfruttando una microsfera immobilizzata sul vetrino portaoggetti, consente di eseguire una calibrazione assistita. \section{Pinzette ottiche} Il fascio \textit{laser} collimato in uscita da una sorgente \ce{Nd}:\ce{YVO4} attraversa immediatamente una serie di due isolatori ottici, necessari per ridurre al minimo le instabilità della sorgente dovute alla retro-riflessione. Successivamente, dopo aver attraversato una lamina $\lambda/2$, viene diviso in due fasci ortogonali da un cubo polarizzatore. I due fasci avranno polarizzazioni parallele o perpendicolari rispetto alla superficie del tavolo ottico, e la lamina $\lambda/2$ consente di modificare la ripartizione di potenza tra i due rami. I due rami vengono ricombinati utilizzando un secondo cubo polarizzatore, dopo aver attraversato due modulatori acusto-ottici (\textit{Acousto Optic Modulator, AOM}). Gli AOM vengono realizzati ponendo un cristallo di diossido di tellurio (\ce{TeO2}) in contatto con un trasduttore piezoelettrico: la radiofrequenza trasmessa al trasduttore consente l'instaurazione di un onda stazionaria acustica all'interno del cristallo, che si comporta sostanzialmente come un reticolo di diffrazione. Variando l'ampiezza e la frequenza del segnale elettrico inviato agli AOM è possibile modificare le caratteristiche dell'onda acustica stazionaria nel cristallo, e quindi ottenere una deflessione e una modulazione del fascio in uscita. Gli elementi ottici sono allineati in modo che quanto a entrambi gli AOM viene applicata una radiofrequenza di \SI{75}{MHz} i due rami incidano perpendicolarmente sull'ultimo cubo polarizzatore e proseguano il loro percorso esattamente sovrapposti (linea continua nella figura \ref{fig:aom}). \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=\linewidth]{images/aom.pdf} \caption{Schema per la realizzazione di due pinzette ottiche indipendenti.} \label{fig:aom} \end{figure} Una coppia di lenti piano-convesse con distanze focali di \SIlist{??;??}{\mm} incrementa la dimensione del fascio e rende il piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il piano delle uscite degli AOM. In questo modo, per qualsiasi deflessione angolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappole passeranno sempre collimati per il centro del piano focale posteriore dell'obiettivo, con angolo d'incidenza dipendente dalla radiofrequenza applicata. I fasci, quindi, attraversano l'obiettivo e vengono focalizzati dentro il campione propagandosi parallelamente all'asse ottico principale. La variazione di angolo di incidenza nel piano focale posteriore dell'obiettivo si tradue in uno spostamento orizzontale dei fasci nel piano del campione: in questo modo, regolando la radiofrequenza degli AOM è possibile spostare la posizione delle trappole lungo una linea orizzontale all'interno del campione. I fattori di conversione tra posizione della trappola nel campione e frequenza inviata all'AOM, determinati dalle caratteristiche degli AOM e dalla geometria del sistema ottico, vengono determinati a posteriori visualizzando microsfere intrappolate e creando rette di calibrazione. I modulatori acusto-ottici utilizzati (AA Opto-Electronic, DTSXY-250) sfruttano onde acustiche di taglio e richiedono una polarizzazione in ingresso lineare e perpendicolare all'onda acustica. Per questo nel percorso ottico vengono aggiunte due ulteriori lamine $\lambda / 2$: una permette di aver per entrambi gli AOM la stessa polarizzazione in ingresso, la seconda ruota nuovamente di \SI{90}{\degree} la polarizzazione di uno dei due fasci in modo che abbiano polarizzazione ortogonali prima di ricombinarsi. L'intervallo di scansione angolare consentito da questi AOM è di circa \SI{2.8}{\degree}, corrispondenti a variazioni di \SI{50}{\MHz} nella radiofrequenza fornita. Lungo questo intervallo l'efficienza dell'AOM, ovvero la frazione di fascio deflessa nel primo ordine di diffrazione, può variare significativamente. Questo dipendenza può essere nociva per gli esperimenti con le pinzette ottiche: se l'intensità dei fasci non è uniforme per tutte le posizioni della trappola, la rigidità di essa varierà durante gli spostamenti, rendendo difficile la manipolazione del campione attraverso lunghe distanze e potenzialmente falsando i risultati degli esperimenti. Variando l'angolo di incidenza del fascio rispetto all'AOM è possibile ottimizzare questa dipendenza intorno a un intervallo di deflessioni angolari di nostro interesse. Resta comunque una variazione non trascurabile della rigidità delle trappole in funzione della posizione e per tenerne conto si utilizza un'apposita procedura di calibrazione in cui la rigidità viene misurata osservando la diffusione di una microsfera nella trappola, per una griglia equispaziata di punti. Per poter osservare e registrare gli spostamenti delle microsfere nella trappole così realizzate è stato implementato un sistema di rilevamento della radiazione diffusa nel piano focale posteriore (\textit{back-focal plane detection}, BFPD). \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=\linewidth]{images/bfp.pdf} \caption{Principio di funzionamento della \textit{back-focal-plane detection} e andamento della sensibilità al variare della dimensione dello \textit{spot}} \label{fig:my_label} \end{figure} Il profilo d'intensità della luce diffusa in avanti da una microsfera in una trappola ottica, rilevato nel piano focale posteriore, permette di conoscere la posizione relativa della microsfera rispetto al centro della trappola, senza dipendere (in condizioni ideali) dalla posizione assoluta della trappola nel campione. Per sfruttare questa proprietà la radiazione a \SI{1064}{\nm} è estratta dal cammino ottico successivo al condensatore grazie ad uno specchio dicroico. Successivamente le due polarizzazioni, corrispondenti alle due trappole, vengono separate da un cubo polarizzatore, e inviate rispettivamente a due fotodiodi a quadranti (\textit{Quadrant Photodiode Detector, QPD}), posizionati in un piano coniugato con il piano focale posteriore del condensatore. In questo piano la distribuzione spaziale del campo elettrico è data dalla trasformata di Fourier del campo in corrispondenza del piano del campione messo a fuoco. È possibile dimostrare che nel caso di una sfera spostata rispetto al centro della trappola l'asimmetria del profilo d'intensità nel piano focale posteriore sarà direttamente proporzionale allo spostamento della sfera rispetto al centro della trappola. Grazie ai due QPD possiamo quindi quantificare l'asimmetria del profilo d'intensità della radiazione diffusa in avanti lungo due assi ortogonali, ottenendo letture proporzionali agli spostamenti relativi della microsfera. Queste letture vengono prodotte da un sistema di amplificatori differenziali che opera sui quattro quadranti, producendo in uscita segnali la cui tensione, dopo opportuna calibrazione, può essere messa in relazione allo spostamento della microsfera. \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=\textwidth]{images/qpd.pdf} \caption{Schema per la rilevazione della posizione relativa della microsfera.} \label{fig:qpd} \end{figure} Maggiori dettagli sull'elettronica che consente il controllo della deflessione attraverso gli AOM e la lettura del segnale dei QPD sono forniti nell'appendice \ref{app:electronics}, mentre le procedure di calibrazione sono trattate nella sezione \ref{sec:calibration}. \section{Fluorescenza} Il percorso di eccitazione per la microscopia di fluorescenza è realizzato a partire da tre sorgenti \textit{laser}: \begin{itemize} \item \textbf{\SI[detect-weight = true]{488}{\nm}:} Cobolt MLD™ 488, con potenza regolabile tra \SIlist{0;60}{\mW} attraverso programma di controllo. \item \textbf{\SI[detect-weight = true]{532}{\nm}:} Coherent Sapphire, con potenza regolabile tra \SIlist{0;200}{\mW} attraverso manopola di controllo. \item \textbf{\SI[detect-weight = true]{635}{\nm}:} Blue Sky Research FTEC-2-635, con potenza regolabile tra \SIlist{0;60}{mW} attraverso modulazione analogica in tensione. \end{itemize} Le tre sorgenti si trovano fuori dal tavolo ottico e la radiazione viene trasportata attraverso tre fibre ottiche. Sul tavolo ottico la radiazione viene emessa nello spazio libero tramite tre collimatori con specifiche diverse. \begin{table}[ht] \centering \begin{tabular}{c c c c} \toprule $\lambda [\si{\nm}]$ & f [\si{\mm}] & $(\textrm{BD})_{1/e^2} ~[\si{\mm}] & M$\\ \midrule 488 & 4 & 0.49 & 3.33x\\ 532 & 11 & 1.57 &\\ 635 & 6 & 1.07 & 1.66x\\ \bottomrule \end{tabular} \caption{Collimatori usati per estrarre i fasci alle varie lunghezzed d'onda, con distanza focale indicata dal costruttore (f) e diametro del fascio (BD) misuratomediante fit gaussiano.} \label{tab:my_label} \end{table} I fasci a \SIlist{488;635}{\nm} vengono ingranditi mediante due telescopi realizzati con lenti piano-convesse. L'emissione dei laser a diodo risulta \section{Apparto sperimentale} In figura \ref{fig:setup} è mostrato uno schema integrale dell'apparato realizzato. Le componenti principali sono descritte nella sezione \ref{sec:setup}. Successivamente, nella sezione \ref{sec:stabilization} è descritto il sistema di stabilizzazione meccanica introdotto per compensare lo spostamento del campione dovuto a deriva termica e oscillazioni acustiche. Nella sezione \ref{sec:calibration} è descritta nel dettaglio la procedura usata per la calibrazione dei parametri delle trappole ottiche. L'esperimento tipico utilizzato per studiare l'interazione tra una proteina e un microfilamento di actina consiste in un saggio a tre sfere, o \textit{3-beads assay}. I dettagli per la realizzazione di questo esperimento sono illustrati nella sezione \ref{sec:three-beads}. \begin{sidewaysfigure} \includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/Setup.pdf} \caption{Caption} \label{fig:setup} \end{sidewaysfigure} \begin{sidewaystable} \centering \begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l} \toprule Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\ \midrule \multicolumn{5}{l}{\it Fluorescence Excitation Path}\\ F-Clean635 & Bandpass Filter & \SI{635}{\nm} laser clean-up & $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm}, bw: \SI{14}{\nm}$ & FF01-640/14-25\\ L-TS1a & Plano-Convex Spherical Lens & Telescope for \SI{635}{\nm} laser & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS1b & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS2a & & Telescope for \SI{488}{\nm} laser & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS2b & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ DIC-532 & Single-edge Dichroic Filter & Excitation beam multiplexing & $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$ & Di02-R532-25-D\\ DIC-488 & & & $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$ & Di02-R488-25-D\\ L-TS3a & Achromatic Doublet & Telescope for comb. ex. lasers & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS3b & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-Exc & & Excitation beam focusing & f: \SI{0}{\mm} & \\ DIC-Fluor & Quad-edge Dichroic Filter & Excitation/Emission separation & $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$ & Di03-R405/488/532/635-t1 \\ \multicolumn{5}{l}{\it Tweezers Path}\\ L-TS4a & Plano-Convex Spherical Lens & Telescope matching isolator size & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS4b & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS5a & Plano-Convex Spherical Lens & Telescope after isolator & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-TS5b & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-Twz1 & Plano-Convex Spherical Lens & Telescope after isolator & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-Twz2 & & & f: \SI{0}{\mm} & \\ DIC-Twz1 & Single-edge Dichroic Filter & Tweezer beam insertion & $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$ & \\ \multicolumn{5}{l}{\it Imaging Path}\\ L-Im1 & Tube Lens & Tube Lens & f: \SI{0}{\mm} & \\ L-Im2 & Imaging Lens & Imaging Lens & f: \SI{0}{\mm} & \\ DIC-BF & Single-edge Dichroic Filter & Fluorescence/Brightfield demux & $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$ & FF705-Di01-25x36\\ F-BlockBF & Shortpass Filter & Residual brightfield suppression & $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$ & FESH0700\\ F-Emiss & Quad-band bandpass Filter & Fluorophore emission filtering & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$ & FF01-446/510/581/703\\ F-BlockTwz & Bandstop filter & Fluorophore emission filtering & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$ & FF01-446/510/581/703\\ \end{tabular} \caption{Caption} \label{tab:my_label} \end{sidewaystable}