\chapter{Metodi} \label{cap:methods} %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% \section{Stabilizzazione meccanica} \label{sec:stabilization} Nonostante l'isolamento meccanico fornito dagli elastomeri e dal tavolo ottico la posizione del campione rispetto al centro dell'obiettivo e la quota del piano focale sono soggette a fluttuazioni e derive. Gli effetti più evidenti e rilevabili sono rapide oscillazioni della posizione del campione dovute a vibrazioni acustiche residue e una progressive deriva rispetto alla posizione fissata che diventa significativa ($> \SI{100}{\nm}$) per tempi di osservazione di diversi minuti. Per quantificare quest'effetto viene usato un apposito campione in cui diverse microsfere in silice, di diametro \SI{0.5}{\um}, vengono immobilizzate in uno strato di nitrocellulosa depositato nella superficie interna del vetrino coprioggetti. Le varie fasi per la preparazione di questo campione sono descritte nei particolari nell'appendice \ref{app:protocols}, protocollo \ref{proto:silica_beads_flow_cell}. Le microsfere immobilizzate nel campione possono essere messe a fuoco e visualizzate attraverso il sistema di microscopia a luce trasmessa. Una volta selezionata e messa a fuoco una microsfera, analizzando l'immagine prodotta da uno dei due sensori CMOS è possibile calcolare le coordinate (in pixel) del suo centroide: \begin{equation} (x_{cen}, y_{cen}) = \frac{ \sum_{(x, y)} (x, y) I(x, y) }{ \sum_{(x, y)} I(x, y) } \end{equation} Per evitare di considerare altre microsfere o imperfezioni sul campione si sceglie di effettuare il calcolo del centroide limitando la regione dell'immagine utilizzata a un rettangolo nel quale una microsfera è sufficientemente isolata. Ricalcolando il centroide intervalli temporali fissati è possibile osservare la deriva della posizione (x, y) della microsfera. Inoltre è possibile sfruttare questo stesso campione per effettuare una calibrazione del fattore di conversione pixel/nm lungo due assi ortogonali. Per effettuare la calibrazione, dopo aver calcolato il centroide della microsfera, si sposta la posizione dal campione lungo uno dei due assi di una distanza ben definita, utilizzando il traslatore piezoelettrico. A questo punto, calcolando la nuova posizione del centroide si ottiene il rapporto tra lo spostamento comandato al traslatore (in \si{\nm}) e la variazione del centroide (in pixel). Ripetendo questa operazione in sequenza per vari punti si ottiene una curva di calibrazione per l'asse scansionata, dalla quale è possibile estratte la costante di proporzionalità con un \textit{fit} lineare. Risulta più complesso invece stimare la deriva del piano focale: per questo motivo è stato sviluppato un metodo per determinare a partire dalle immagini un valore che sia linearmente proporzionale alla quota del piano focale rispetto al centro della sfera. Il metodo sviluppato sfrutta le caratteristiche dalla distribuzione radiale della luce diffusa dalla microsfera. In figura \ref{fig:radial_itensity} rappresentato l'andamento del profilo radiale variando la quota del piano focale (z). \begin{figure}[h] \centering \includegraphics{images/radial_intensity.pdf} \caption{Profilo di indensità radiale rispetto al centroide per una microsfera, in diversi piani } \label{fig:radial_itensity} \end{figure} Da questi dati è stato possibile osservare che il rapporto tra l'intensità integrata in un anello centrato sulla microsfera e quella integrata nella regione interna al medesimo anello (regioni gialle e arancioni in figura), mostra un andamento proporzionale alla quota del piano focale, almeno in un certo intorno del centro della sfera. In figura \ref{fig:z_est} viene mostrato l'andamento del rapporto tra l'intensità media in un anello con raggio interno ed esterno rispettivamente di \SIlist{80;160}{pixel} e l'intensità media calcolata in un raggio di \SI{60}{pixel}. \begin{figure}[h] \centering \includegraphics{images/z-est.pdf} \caption{Andamento del rapporto intensità anello/cerchio in funzione della quota del piano focale.} \label{fig:z_est} \end{figure} Come si può osservare la quantità così definita può essere usata per determinare la quota con una discreta sensibilità in un intervallo di \SIrange{3}{4}{\um} intorno al centro della sfera. Analogamente a quanto fatto per le assi x e y è possibile eseguire una calibrazione spostando il campione di una quota controllata attraverso il traslatore piezoelettrico dell'obiettivo, e costruire una curva di calibrazione come quella in figura \ref{fig:z_est}. Conoscendo quindi tre fattori di calibrazione è possibile, partendo da un'immagine della microsfera, ottenere una stima della sua posizione nello spazio tridimensionale. Questo fatto ci permette di implementare un sistema attivo di stabilizzazione meccanica del microscopio. Continuando a monitorare la sfera mediante mentre si eseguono le misurazioni di forza è possibile rilevare gli spostamenti del campione e compensarli inviando appositi comandi ai traslatori piezoelettrici. In ambiente LabVIEW è stato sviluppato un codice di controllo che implementa un meccanismo di retroazione tra le letture sulla posizione della sfera e i traslatori piezoelettrici. Il codice consente all'operatore di selezionare la regione d'interesse intorno a una microsfera immobilizzata sul vetrino coprioggetti. Successivamente, quando la stabilizzazione viene attivata, il codice acquisice diverse immagini della microsfera e ne stima la posizione iniziale in termini di coordinate (x, y, z), usando i fattori di conversione determinati con la calibrazione. A questo punto viene avviato un ciclo di retroazione: continuando a acquisire immagini della microsfera (a una frequenza che può arrivare fino a \SI{100}{\Hz}), viene comandato ai traslatori uno spostamento proporzionale alla differenza tra la posizione della sfera rilevata e quella iniziale. Quando il sistema di stabilizzazione meccanica viene attivato è stato possibile mostrare che la posizione media del campione resta stabile indipendentemente dal tempo di osservazione, con fluttuazione che hanno una deviazione standard di circa \SI{1}{\nm}. Introdurre nel ciclo di controlla alla componente proporzionale una componente integrale o derivativa non altera significativamente la stabilizzazione raggiunta. L'acquisizione di diverse tracce della durata di 5-10 minuti ha sempre mostrato deviazioni standard delle fluttuazioni comprese tra \SIlist{1;2}{\nm}. \section{Calibrazione parametri trappole} \label{sec:calibration} Per poter eseguire misurazioni di forza su sistemi biologici è fondamentale riuscire a conoscere il valore della tensione applicata alle microsfere intrappolate nelle pinzette ottiche. Questo è possibile dal momento che l'azione di una pinzetta ottica su una microsfera può essere modellizzata come una forza di richiamo elastica (vedi sezione \ref{sec:ot}). Conoscendo la costante di richiamo è possibile mettere in relazione la posizione della sfera rispetto al centro della trappola (rilevabile tramite i QPD) con la risultante delle altre forze esterne che agiscono sulla microsfera. Quando la microsfera viene messa in movimento da una forza esterna, è necessario considerare anche l'attrito viscoso con il fluido in cui è immersa. La forza dovuto all'attrito viscoso avrà la forma: \begin{equation} \vec{F}_{visc} = - \gamma \vec{v}\ \end{equation} Dove $\gamma$ è il coefficiente di attrito idrodinamico della microsfera. Nel caso più generele la microsfera sarà inoltre soggetta a una sforza stocastica ($\eta(t)$), dovuta agli urti con il fluido, e a una forza esterna $\vec{F}$, ad esempio dovuta alle tensione di una biomolecola legata ad essa. Possiamo quindi scrivere la forma più generale dell'equazione di moto come: \begin{equation} \label{eq:bead_motion} \underbrace{m \ddot{\vec{x}}}_\text{inerzia} = \underbrace{\vec{F}}_\text{f. esterna} + \underbrace{\mathbf{\eta}(t)}_\text{f. stoc.} - \underbrace{\gamma \dot{\vec{x}}}_\text{attrito} - \underbrace{k \vec{x}}_\text{richiamo} \end{equation} La forza stocastica $\eta(t)$ ha media nulla ($\langle\eta(t)\rangle_t = 0$) e viene assunta con distribuzione di probabilità gaussiana con $\sigma^2 = 2 k_B T \gamma$. In condizioni di equilibrio la posizione media della microsfera sarà quindi: \begin{equation} \vec{x_0} = \langle \vec{x(t)} \rangle_t = - \frac{\vec{F}}{k} \end{equation} E la deviazione standard delle fluttuazioni rispetto alla posizione di equilibrio può essere determinata usando il teorema di equipartizione dell'energia: \begin{multline} \langle U(x) \rangle = \frac{1}{2} k \langle (x-x_0)^2 \rangle = \frac{1}{2} k_B T \\ \Longrightarrow \langle (x-x_0)^2 \rangle = \langle x^2 \rangle - \langle x \rangle^2 = \sigma_x^2 = k_B T / k \end{multline} Oltre alla conoscenza di $k$ un altro valore importante da stimare è il tempo di rilassamento $\tau$ del sistema, ovvero la scala temporale nella quale la microsfera si stabilizza nella nuova posizione di equilibrio a seguito di una variazione della forza $F$. Questo tempo è strettamente legato allo smorzamento dovuto all'attrito idrodinamico. Osservando l'equazione di moto \ref{eq:bead_motion} si può descrivere la dinamica della sfera in due regimi estremi: \begin{itemize} \item il regime \textit{balistico}, quando il moto è dominato dalla componente inerziale, con un tempo caratteristico di rilassamento $\tau_\text{bal} = m / \gamma$. \item il regime \textit{diffusivo}, qunado il termine inerziale legato alla massa è trascurabile, con un tempo di rilasamento $\tau_\text{diff} = \gamma / k$. \end{itemize} Tenendo conto delle caratteristiche delle microsfere si hanno valori $\tau_\text{bal} < \SI{1}{\us}$, mentre per i valori di $k$ ottenibili con il nostro sistema di pinzette ottiche è possibile ridurre $\tau_\text{diff}$ fino a circa \SI{100}{\us}. Il tempo di risposta del sistema nel regime balistico è quindi completamente trascurabile, e il transiente tra una perturbazione e la stabilizzazione nella nuova posizione di equilibrio può essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto. Il protocollo di calibrazione sviluppato consente, partendo dalle tracce temporali della posizione relativa della microsfera un'asse spaziale, di determinare con precisione i valori di $\tau$, e quindi di $k$ per ogni posizione della trappola. Per fare questo si tiene contro che la densità spettrale delle fluttuazioni di posizione è data da \cite{Gittes1998}: \begin{equation} S_x(\nu) = \frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)} \end{equation} Dove $\nu_c = 1 / (2\pi\tau) = k / 2\pi\gamma$ é la frequenza di taglio, inversamente proporzionale al tempo di rilassamento. Da un semplice $fit$ della distribuzione spettrale di rumore della posizione è possibile quindi estrarre il valore di k. Il segnale misurabile in uscita dagli amplificatori differenziali dei QPD è un segnale in tensione, compreso tra \SIlist{-10;+10}{\V}, proporzionale alla posizione relativa della microsfera. Tramite il fit dei dati possiamo anche ottenere il fattore di conversione $\beta$ tale che $x_{rel}(V) = \beta V$. La distribuzione spettrale di rumore, riscalata rispetto alla variabile $V$ sarà quindi: \begin{equation} S_V(\nu) = \frac{1}{\beta^2}\frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)} \end{equation} Per la calibrazione si procede a preparare un campione con una cella di flusso contenente microsfere di polistirene (di diametro \SI{0.9}{\um}). Grazie a un'apposito programma sviluppato in ambiente LabVIEW (\texttt{Force-Clamp Calibration}) è possibile acquisire in maniera automatizzata le tracce del segnale prodotto dai QPD per una griglia di posizioni delle trappole. Il codice si occupo di memorizzare le tracce temporali per ogni posizione spostare la trappola modificando la frequenza inviata agli AOM. Le tracce temporali vengono acquisite per una durata di \SI{10}{\second} per ogni posizione e una frequenza di campionamento di \SI{200}{kS/s}. In seguito viene calcolata per ogni posizione di ciascuna trappola la distribuzione spettrale di rumore, utilizzando un algoritmo per la trasformata di Fourier veloce (\textit{Fast Fourier Transform}, FFT), con i seguenti parametri riportati in tabella \ref{tab:fft_par}. \begin{table}[h] \centering \begin{tabular}{>{\bf}l l} \toprule Accumulo medie & Metodo di Welch\cite{Welch1967} \\ {\it Segmenti accumulati} & 32 \\ {\it Lunghezza segmenti} & N/32 \\ \midrule Finestra & Hann \\ \midrule \bottomrule \end{tabular} \caption{Parametri FFT} \label{tab:fft_par} \end{table} Su ciascuno spettro viene eseguito un \textit{fit} per determinare i valori di $\beta$ e $k$ imponendo i valori noti riportati in tabella \ref{tab:fit}. \begin{table}[h] \centering \begin{tabular}{l l l} \toprule Parametro & Simbolo & Valore \\ \midrule Raggio della sfera & $R$ & \SI{450}{\nm} \\ Temperatura & $T$ & \SI{295}{\K} \\ Distanza sfera da superificie & $d$ & \SI{1}{\um} \\ Viscosità & $\eta$ & \SI{1e-3}{Pl} \\ Coefficiente attrido idrodinamico & $\gamma$ & $6 \pi \eta R \left(1+\frac{9R}{16d}\right)$\\ Frequenza minima & $\nu_\text{min}$ & \SI{15}{\Hz} \\ Frequenza massima & $\nu_\text{max}$ & \SI{50}{\kHz} \\ \bottomrule \end{tabular} \caption{Parametri $fit$ distribuzione spettrale} \label{tab:tab:fit} \end{table} In figura \ref{fig:psd} si riporta una distribuzione spettrale tipica confrontata con la funzione teorica. \begin{figure} \centering \includegraphics{images/PSD.pdf} \caption[scale=0.8]{Densità spettrale di rumore per la posizione di una trappola ottica.} \label{fig:psd} \end{figure} \section{Retroazione AOM e \textit{force-clamp}} \label{sec:force-clamp} \section{Saggio a tre sfere} \label{sec:three-beads} \section{Fluorescenza di singola molecole} \label{sec:single_molecule_fluorescence} \section{TIRF e illuminazione a modi di galleria} \label{sec:gallery_mode}