\chapter{Conclusione e prospettive future}
\label{cap:results}

Nello svolgimento di questo lavoro di tesi è stata esplorata la possibilità
di utilizzare tecniche di microscopia e manipolazione ottica avanzate e
ultraveloci per caratterizzare le proprietà meccaniche di complessi di
biomolecole interagenti.

Queste proprietà, in particolare la modulabilità delle proprietà dinamiche
delle interazioni attraverso l'applicazione di stimoli meccanici controllati,
sono alla base della \textit{meccanotrasduzione}, ovvero di ogni processo
che consente la traduzione di un segnale di tipo meccanico in segnali
biochimici capaci di alterare il funzionamento di cellule e organismi.

Per decifrare i meccanismi fondamentali alla base della meccanotrasduzione
è stato considerato un approccio in cui un insieme minimo
``funzionale'' di biomolecole viene isolato dal resto del rumoroso ambiente
cellulare, in modo da poter controllare con estrema precisione la posizione
e il numero delle molecole interagenti, e da poter rilevare e caratterizzare
anche interazioni transienti e di breve intensità, con tempi di vita media
inferiori al millisecondo.

La scelta di un approccio di questo tipo, se da una parte consente
l'osservazione e la caratterizzazione di meccanismi di interazione altrimenti
invisibili, è però intrinsecamente limitata dalla necessità di porre il
sistema in condizioni molto diverse da quelle fisiologiche, in cui un numero
elevato di molecole diverse in natura è responsabile delle proprietà
meccaniche dei tessuti cellulari e della formazione e modulazione di segnali
biochimici.

Con questo lavoro di tesi si è voluto mostrare come questa limitazione sia
tecnicamente superabile andando ad accoppiare, a tecniche di spettroscopia
di forza già regolarmente utilizzate, schemi di microscopia di singola
molecola.
Così facendo, infatti, è possibile aumentare il numero di molecole 
osservate nello stesso tempo: mentre l'interazione tra due molecole viene
monitorata accuratamente sotto condizioni meccaniche controllate,
l'eventuale attivazione di cofattori terzi interagenti può essere rilevata
grazie alla microscopia di fluorescenza.

Correlando temporalmente queste due informazioni in un unico esperimento, è
possibile caratterizzare e quantificare un insieme di meccanismi fondamentali
per la meccanotrasduzione molto più ampio di quello esplorabile con le
due tecniche separatamente.

Per combinare efficacemente un sistema di spettroscopia di forza
ultraveloce basato su pinzette ottiche con schemi di microscopia di singola
molecola è necessario confrontarsi con una serie di limitazioni sia di
natura ingegneristica che teorica.
In particolare, è necessario evitare ogni possibile \textit{crosstalk} tra
le differenti modalità di acquisizione usate allo stesso tempo senza però
ridurre la qualità, in termini di rapporto segnale/rumore,
dei dati acquisiti.

Per questo motivo, anche se le tecniche di microscopia di singola molecola
e di spettroscopia di forza risultano usate routinariamente da qualche
tempo, non è stata ancora ancora sufficientemente esplorata la possibilità
di un loro uso combinato in biofisica.

Con questo lavoro di tesi si è realizzato un apparato di misura in grado
di combinare la rilevazione in fluorescenza di singola molecola alla
spettroscopia di forza \textit{force-clamp}, dimostrando la possibilità
di ottenere misure di interazione con la stessa precisione e sensibilità
raggiungibili in un apparato di spettroscopia force-clamp isolato.

Inoltre, è stata esplorata la possibilità di sfruttare le proprietà ottiche
dei materiali usati negli esperimenti per incrementare il rapporto
segnale/rumore in microscopia di fluorescenza. A questo riguardo, ulteriori
approfondimenti sulla possibilità di usare microsfere dielettriche come
risuonatori ottici si rendono necessari e potranno essere oggetto di uno 
studio futuro.

Un sistema sul quale può essere estremamente proficuo applicare questo tipo
di misurazioni è quello delle giunzioni cellulari, in particolare quelle
\textit{aderenti} o \textit{occludenti}, dove l'interazione tra diverse specie
di proteine è fondamentale per ottenere un ampia gamma di proprietà meccaniche
osservabili nei tessuti viventi. In questi sistemi, nonostante la complessità
e varietà degli effetti macroscopici osservabili, è ancora possibile
individuare sottoinsiemi di specie di proteine sufficientemente limitati per
poter essere studiati con un metodo come quello descritto in questo lavoro.

Le giunzioni cellulari presentano ancora molti aspetti incompresi, soprattutto
manca ancora una accurata descrizione a livello molecolare dei meccanismi
di interazione responsabili della meccanotrasduzione. Proprio per questo
motivo rappresentano un ottimo banco di prova per l'applicazione delle
metodiche descritte.

Per quanto riguarda le \textit{giunzioni aderenti},
l'osservazione diretta di come il legame tra le proteine \textit{vinculina}
e $\alpha$\textit{-catenina} possa modulare l'interazione di quest'ultima
con i filamenti di \textit{actina} potrebbe permettere di determinare il ruolo,
ancora non chiaro, della \textit{vinculina} nella regolazione delle proprietà
della giunzione. Una realizzazione sperimentale di questa misura
è possibile utilizzando l'apparato realizzato e marcando con una sonda
fluorescente la \textit{vinculina}, mentre allo stesso tempo la cinetica
dell'interazione actina-$\alpha$\textit{-catenina} viene registrata con il 
sistema di spettroscopia \textit{force-clamp} (figura \ref{fig:exp_aj}).

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics[width=0.6\linewidth]{images/exp_aj.pdf}
    \caption{Ipotesi di esperimento per lo studio dell'interazione tra
    alfa-catenina, actina e vinculina.}
    \label{fig:exp_aj}
\end{figure}

Analogamente, nel caso delle \textit{giunzioni occludenti}, 
il ruolo della proteina \textit{cingulina} nel regolare l'attività della
proteina ZO-1, responsabile di connettere il dominio extra-cellulare della
giunzione alle strutture di sostegno intra-cellulari, non è ancora
completamente chiaro.
In questo caso è possibile ipotizzare, sempre utilizzando l'apparato
sperimentale realizzato, una misura in cui la cinetica dell'interazione
tra la proteina ZO-1 (o di un frammento di essa) con filamenti di actina
viene registrata osservando, contemporaneamente, l'eventuale presenza
di cingulina marcata con sonde fluorescenti in prossimità della regione
di interazione (figura \ref{fig:exp_tj}).

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics[width=0.6\linewidth]{images/exp_tj.pdf}
    \caption{Ipotesi di esperimento per lo studio dell'interazione tra
    ZO-1, actina e cingulina.}
    \label{fig:exp_tj}
\end{figure}

In conclusione, si ritiene che l'approccio sperimentale descritto in questa
tesi abbia le caratteristiche necessarie per rispondere ai quesiti ancora
aperti sul funzionamento, a livello molecolare, di diversi meccanismi
di \textit{meccanotrasduzione}, e possa fornire misure quantitative sul
rapporto tra forze esterne applicate, cinetiche di interazione e regolazione
delle funzioni cellulari.

