diff --git a/chapters/1-introduction.tex b/chapters/1-introduction.tex index a206a7c..342190f 100644 --- a/chapters/1-introduction.tex +++ b/chapters/1-introduction.tex @@ -55,9 +55,10 @@ meccanici, termodinamici e biochimici. Lo scopo di questo lavoro di tesi è, sviluppare, in gran parte \textit{ex-novo}, un apparato sperimentale per lo studio della meccano-trasduzione in contesti complessi come quello delle giunzioni -cellulari, basato sulla manipolazione ottica di due proteine interagenti -e il \textit{tracking} simultaneo, tramite microscopia di fluorescenza, -di altre singole biomolecole nei pressi del sito di interazione. +cellulari, basato sulla manipolazione ottica di due proteine +interagenti e il \textit{tracking} simultaneo, tramite microscopia di +fluorescenza, di altre singole biomolecole nei pressi del sito di +interazione. La manipolazione tramite pinzette ottiche rappresenta infatti una strada molto promettente per lo studio, anche quantitativo, di @@ -71,20 +72,24 @@ complessi proteici sottoponendo due molecole interagenti a stress meccanici controllati e andando a osservare come la dinamica delle interazioni dipenda dalle forze esterne. -Questo tipo di esperimenti si riconduce alle \emph{spettroscopie di forza}, +Questo tipo di esperimenti si riconduce alle +\emph{spettroscopie di forza}, che in generale vengono realizzate utilizzando diverse tecniche, come -la microscopia a forza atomica, le onde acustiche o le pinzette ottiche. -I brevissimi tempi di risposta ottenibili utilizzando queste ultime, inferiori -al millisecondo, hanno fatto si che le pinzette ottiche fossero applicate -con successo allo studio di sistemi interagenti con affinità molto deboli -o rapide modifiche conformazionali, come i motori molecolari \cite{??}. - -L'apparato sperimentale descritto in questo lavoro consiste sostanzialmente -in una ricostruzione di quello utilizzato in \cite{??} per lo studio dei motori -molecolari per quanto riguarda la componente di spettroscopia di forza, integrato -con un sistema di microscopia di fluorescenza che consenta di osservare -simultaneamente la dinamica di singole molecole interagenti con le proteine -intrappolate. +la microscopia a forza atomica, le onde acustiche o le pinzette +ottiche. +I brevissimi tempi di risposta ottenibili utilizzando queste ultime, +inferiori al millisecondo, hanno fatto si che le pinzette ottiche +fossero applicate con successo allo studio di sistemi interagenti con +affinità molto deboli o rapide modifiche conformazionali, come i +motori molecolari \cite{Capitanio2012}. + +L'apparato sperimentale descritto in questo lavoro consiste +sostanzialmente in una ricostruzione di quello utilizzato in +\cite{Capitanio2012} +per lo studio dei motori molecolari per quanto riguarda la componente +di spettroscopia di forza, integrato con un sistema di microscopia di +fluorescenza che consenta di osservare simultaneamente la dinamica di +singole molecole interagenti con le proteine intrappolate. Infatti, fino a ora il principale limite di questi esperimenti è stato quello di produrre informazioni dinamiche @@ -92,56 +97,71 @@ esclusivamente sui due componenti interagenti selezionati per la spettroscopia di forza, trascurando ogni altra possibile interazione. Se in diversi scenari questo è più che sufficiente, alcuni sistemi biologici, questo approccio mostra evidenti limiti nello -studio di una complessa rete di interazioni come quella delle giunzioni -cellulari. +studio di una complessa rete di interazioni come quella delle +giunzioni cellulari. Un apparato con queste caratteristiche dovrebbe consentire, durante un esperimento di spettroscopia di forza, di registrare -simultaneamente sia la risposta meccanica delle due proteine immobilizzare, -sia l'eventuale interazione con altri fattori opportunamente marcati presenti -nella soluzione usata per l'esperimento. +simultaneamente sia la risposta meccanica delle due proteine +immobilizzare, sia l'eventuale interazione con altri fattori +opportunamente marcati presenti nella soluzione usata per +l'esperimento. -L'ostacolo principale al raggiungimento di questo -risultato è dato dalla difficoltà di visualizzare, -tramite microscopia ottica, l'attività di una singola -molecola fluorescente sopra un fondo di fluorofori -liberi in soluzione. +L'ostacolo principale al raggiungimento di questo risultato è dato +dalla difficoltà di visualizzare, tramite microscopia ottica, +l'attività di una singola molecola fluorescente sopra un fondo di +fluorofori liberi in soluzione. Una soluzione tipicamente adottata prevede l'uso di schemi di illuminazione come la riflessione interna totale (TIRF, \textit{Total Interal Reflection Fluorescence microscopy}) -o i fogli di luce inclinati (HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet microscopy}), in modo da ridurre il volume di campione eccitato e quindi l'emissione +o i fogli di luce inclinati +(HILO, \textit{Highly Inclined and Laminated Optical sheet +microscopy}), +in modo da ridurre il volume di campione eccitato e quindi l'emissione di fluorescenza di fondo. -Questi schemi di illuminazione però richiedono che il volume osservato -sia nelle immediate vicinanze della superficie del vetrino coprioggetti usato -per la preparazione del campione, condizione che è impossibile realizzare negli -esperimenti di spettroscopia di forza, dove le proteine vengono funzionalizzate su sfere dielettriche di dimensioni micrometriche. In questo caso infatti il volume di campione -dove si trovano le proteine interagenti ha uno quota significativa (diverse centinaia di -micrometri) rispetto al vetrino coprioggetti. - -Scopo dell'apparato sperimentale sarà anche studiare la possibilità di superare -questo limite usando la sfera dielettrica come risuonatore ottico, e quindi come -strumento in grado di trasferire la radiazione di eccitazione dall'immediata prossimità -del vetrino coprioggetti ai fluorofori presenti in prossimità del sito di interazione. -In questo modo il segnale proveniente da molecole fuori fuoco, lontane dalla microsfera, -sarebbe efficaciemente soppresso. - -Nelle prossime sezioni è possibile trovare una trattazione più approfondita degli -argomenti introdotti, in particolare nella sezione \ref{sec:giunzioni} vengono introdotti -due importanti tipologie di giunzioni cellulari particolarmente interessanti -per studio con un sistema combinato come quello qui descritto. -Nella sezione \ref{sec:ot} vengono trattate in maniera più approfondita le pinzette -ottiche e la loro applicazione agli esperimenti di spettroscopia di forza. -Nella sezione \ref{sec:fluo} vengono introdotti i principali limiti della microscopia di fluorescenza e le soluzioni proposte per il loro superamento. - -Nel capitolo \ref{cap:methods} vengono descritte nel dettaglio le caratteristiche -dell'apparato sperimentale realizzato e le procedure di validazione, calibrazione e -acquisizione dei dati. - -Nel capitolo \ref{cap:results} sono analizzati i dati prodotti durante le operazioni -di validazione dell'apparato sperimentale e delle procedure di misura per valutare -le prestazioni ottenibili e la loro adeguatezza agli esperimenti ipotizzati. +Questi schemi di illuminazione però richiedono requisiti molto +stringenti. +Ad esempio per poter utilizzare la TIRF, come approfondito in sezione +\ref{sec:fluo} è necessario che il volume osservato sia nelle +immediate vicinanze della superficie del vetrino +coprioggetti usato per la preparazione del campione, +condizione che è impossibile realizzare negli esperimenti di +spettroscopia di forza, dove le proteine vengono funzionalizzate su +sfere dielettriche di dimensioni micrometriche. +In questo caso infatti il volume di campione +dove si trovano le proteine interagenti ha uno quota significativa +(diverse centinaia di micrometri) rispetto al vetrino coprioggetti. + +Scopo dell'apparato sperimentale sarà anche studiare la possibilità di +superare questo limite usando la sfera dielettrica come risuonatore +ottico, e quindi come strumento in grado di trasferire la radiazione +di eccitazione dall'immediata prossimità del vetrino coprioggetti ai +fluorofori presenti in prossimità del sito di interazione. +In questo modo il segnale proveniente da molecole fuori fuoco, +lontane dalla microsfera, sarebbe efficacemente soppresso. + +Nelle prossime sezioni è possibile trovare una trattazione più +approfondita degli argomenti introdotti, in particolare nella sezione +\ref{sec:giunzioni} vengono introdotte due importanti tipologie di +giunzioni cellulari particolarmente interessanti per studio con un +sistema combinato come quello qui descritto.\\ +Nella sezione \ref{sec:ot} vengono trattate in maniera più +approfondita le pinzette ottiche e la loro applicazione agli +esperimenti di spettroscopia di forza.\\ +Nella sezione \ref{sec:fluo} vengono introdotti i principali limiti +della microscopia di fluorescenza e le soluzioni proposte per il loro +superamento. + +Nel capitolo \ref{cap:methods} vengono descritte nel dettaglio le +caratteristiche dell'apparato sperimentale realizzato e le procedure +di validazione, calibrazione e acquisizione dei dati. + +Nel capitolo \ref{cap:results} sono analizzati i dati prodotti durante +le operazioni di validazione dell'apparato sperimentale e delle +procedure di misura per valutare le prestazioni ottenibili e la loro +adeguatezza agli esperimenti ipotizzati. % Introduction on the importance of mechanotransduction @@ -159,28 +179,30 @@ le prestazioni ottenibili e la loro adeguatezza agli esperimenti ipotizzati. Le giunzioni cellulari svolgono un ruolo fondamentale per l'esistenza stessa degli organismi multicellulari. -Esse sono infatti responsabili della capacità delle cellule di connettersi -l'una con l'altra e di organizzarsi per formare tessuti e organi con -funzioni specifiche. -Le funzioni delle giunzioni cellulari vanno ben oltre quelle di una passiva -struttura di raccordo: esse sono responsabili, ad esempio, -di veicolare informazioni e -sostanze tra una cellula e l'altra, guidare la loro proliferazione o migrazione, mantenere la stabilità dei tessuti o avviarne la -riparazione quando necessario. +Esse sono infatti responsabili della capacità delle cellule di +connettersi l'una con l'altra e di organizzarsi per formare tessuti e +organi con funzioni specifiche. +Le funzioni delle giunzioni cellulari vanno ben oltre quelle di una +passiva struttura di raccordo: esse sono responsabili, ad esempio, +di veicolare informazioni e sostanze tra una cellula e l'altra, +guidare la loro proliferazione o migrazione, mantenere la stabilità +dei tessuti o avviarne la riparazione quando necessario. \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=0.5\linewidth]{images/adjunc.pdf} - \caption{Sequenza di cellule connesse da \emph{giunzioni aderenti} (sopra) e dettaglio di una giunzione aderente, con indicazione delle principali proteine coinvolte (sotto)} + \caption{Sequenza di cellule connesse da \emph{giunzioni aderenti} + (sopra) e dettaglio di una giunzione aderente, con indicazione + delle principali proteine coinvolte (sotto)} \label{fig:ad_jun} \end{figure} -Le giunzioni cellulari possono connettersi direttamente a strutture interne -della cellula (come il citoscheletro) e si formano dall'auto-assemblamento -di un grande numero di proteine differenti. Per loro natura attraversano -la membrana cellulare andando a formare legami con strutture analoghe -presenti in cellule adiacenti o con strutture intermedie di supporto, -come la matrice extra-cellulare. +Le giunzioni cellulari possono connettersi direttamente a strutture +interne della cellula (come il citoscheletro) e si formano +dall'auto-assemblamento di un grande numero di proteine differenti. +Per loro natura attraversano la membrana cellulare andando a formare +legami con strutture analoghe presenti in cellule adiacenti o con +strutture intermedie di supporto, come la matrice extra-cellulare. Esistono diversi tipi di giunzioni che svolgono funzioni specifiche. Un tipo di giunzione molto comune nei tessuti epiteliali e @@ -191,42 +213,48 @@ Nelle giunzioni aderenti la proteina che direttamente ancora il complesso alla membrana plasmatica è la \emph{caderina}. Questa è una proteina trans-membrana costituita da un dominio di coda citoplasmatico e un dominio di testa esterno alla membrana cellulare. -Il dominio extra-membrana è in grado di dimerizzare con domini analoghi -presenti in cellule adiacenti, formando la giunzione. -Il dominio intra-membrana permette di stabilire un collegamento diretto -tra la giunzione cellulare e il citoscheletro di actina, grazie al legame -con una classe di proteine, le \emph{catenine}, in grado di legarsi sia con -la coda della caderina che con i filamenti di actina del citoscheletro. - -Oltre a questa connessione diretta esistono altre proteine che mantengono -una connessione indiretta, legando ad esempio le catenine con il -citoscheletro. É stato scoperto \cite{??} che le proteine \emph{vinculina} -e \emph{$\alpha$-actinina} svolgono questa attività. - -Sebbene la funzione di questi collegamenti indiretti non sia stata ancora -del tutto compresa, è stato dimostrato che la sua presenza delle proteine -responsabili è fondamentale per il corretto sviluppo dei tessuti. +Il dominio extra-membrana è in grado di dimerizzare con domini +analoghi presenti in cellule adiacenti, formando la giunzione. +Il dominio intra-membrana permette di stabilire un collegamento +diretto tra la giunzione cellulare e il citoscheletro di actina, +grazie al legame con una classe di proteine, le \emph{catenine}, +in grado di legarsi sia con la coda della caderina che con i filamenti +di actina del citoscheletro. + +Oltre a questa connessione diretta esistono altre proteine che +mantengono una connessione indiretta, legando ad esempio le catenine +con il citoscheletro. É stato scoperto \cite{??} che le proteine +\emph{vinculina} e \emph{$\alpha$-actinina} svolgono questa attività. + +Sebbene la funzione di questi collegamenti indiretti non sia stata +ancora del tutto compresa, è stato dimostrato che la sua presenza +delle proteine responsabili è fondamentale per il corretto sviluppo +dei tessuti. Esperimenti su colture cellulari in il gene che codifica l'espressione -della vinculina è stato rimosso suggeriscono come, oltre ad una riduzione -generale dell'adesione tra cellule, si perda alcune funzioni di regolazione +della vinculina è stato rimosso suggeriscono come, oltre ad una +riduzione generale dell'adesione tra cellule, si perda alcune funzioni +di regolazione e modulazione dell'attività delle giunzioni. -La vinculina, quindi, così come altre proteine secondarie, potrebbe avere -un ruolo nel modulare i meccanismi di adesione e svolgere un ruolo nei -processi di meccano-trasduzione. +La vinculina, quindi, così come altre proteine secondarie, potrebbe +avere un ruolo nel modulare i meccanismi di adesione e svolgere un +ruolo nei processi di meccano-trasduzione. -La possibilità di realizzare esperimenti di spettroscopia di forza in cui è -possibile tenere traccia dell'attività di una o più proteine secondarie -apre la strada verso una maggiore comprensione del loro ruolo. +La possibilità di realizzare esperimenti di spettroscopia di forza in +cui è possibile tenere traccia dell'attività di una o più proteine +secondarie apre la strada verso una maggiore comprensione del loro +ruolo. -Lo stato attuale delle conoscenze sulla rete di interazioni che governa e -regola il funzionamento delle giunzioni aderenti è riportato in Appendice, -sotto forma di diagramma delle vie di segnalazione. +Lo stato attuale delle conoscenze sulla rete di interazioni che +governa e regola il funzionamento delle giunzioni aderenti è riportato +schematicamente in Appendice, sotto forma di diagramma delle vie di +segnalazione. \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics{images/aj.pdf} - \caption{Ruolo di \textbf{caderina} e catenine nelle \textit{giunzioni aderenti}} + \caption{Ruolo di \textbf{caderina} e catenine nelle + \textit{giunzioni aderenti}} \label{fig:aj} \end{figure} @@ -255,7 +283,8 @@ con le loro omologhe appartenenti alla cellula adiacente, tra le quali \emph{claudina}, \emph{occludina} e diverse proteine appartenenti alla classe delle \textit{junctional adhesion molecules}, (JAM). -Queste proteine di membrana si legano alla proteina \textit{Zona occludens 1}, ZO-1 che, come mostrato da +Queste proteine di membrana si legano alla proteina +\textit{Zona occludens 1}, ZO-1 che, come mostrato da recenti studi \cite{??}, potrebbe modulare la formazione delle giunzioni e occuparsi della trasduzione di segnali meccanici. @@ -277,16 +306,14 @@ dell'attività della cingulina attraverso microscopia di fluorescenza. - - - - - \section{Manipolazione ottica di molecole biologiche} \label{sec:ot} - -Le pinzette ottiche (o \textit{optical tweezers}, OT) sono strumenti che sfruttano la \emph{forza di radiazione} esercitata da un fascio laser gaussiano altamente focalizzato su materiali dielettrici, in modo da intrappolare e manipolare oggetti microscopici con una precisione sub-nanometrica. +Le pinzette ottiche (o \textit{optical tweezers}, OT) sono strumenti +che sfruttano la \emph{forza di radiazione} esercitata da un fascio +laser gaussiano altamente focalizzato su materiali dielettrici, in +modo da intrappolare e manipolare oggetti microscopici con una +precisione sub-nanometrica. Questa tecnologia sfrutta il gradiente d'intensità di un fascio gaussiano focalizzato interagente con particelle dielettriche immerse @@ -295,34 +322,41 @@ che queste risentano di una forza di richiamo verso una posizione di equilibrio in prossimità del fuoco del fascio. Fin dalla loro ideazione vennero subito messe in luce le potenzialità -di questa tecnica quando applicata alla manipolazione di campioni biologici. +di questa tecnica quando applicata alla manipolazione di campioni +biologici. -Arthur Ashkin fu, nel 1986, il primo a realizzare sperimentalmente delle pinzette ottiche, riuscendo a intrappolare microsfere sintetiche e batteri\cite{Ashkin:86}. Per questo risultato gli fu conferito il premio Nobel nel 2018, \emph{``per le pinzette ottiche e le loro applicazioni ai sistemi biologici''}. +Arthur Ashkin fu, nel 1986, il primo a realizzare sperimentalmente +delle pinzette ottiche, riuscendo a intrappolare microsfere sintetiche +e batteri\cite{Ashkin:86}. Per questo risultato gli fu conferito il +premio Nobel nel 2018, \emph{``per le pinzette ottiche e le loro +applicazioni ai sistemi biologici''}. -Grazie alle pinzette ottiche è possibile intrappolare solidi dielettrici -di diversa dimensione e natura. -Per ottenere la capacità di manipolare individualmente singole molecole, -come le proteine non è possibile procedere ad un intrappolamento diretto. +Grazie alle pinzette ottiche è possibile intrappolare solidi +dielettrici di diversa dimensione e natura. +Per ottenere la capacità di manipolare individualmente singole +molecole, come le proteine non è possibile procedere ad un +intrappolamento diretto. -Si rende necessario quindi sviluppare protocolli per funzionalizzare la -superficie di sfere dielettriche e legarci le molecole che intendiamo -studiare. +Si rende necessario quindi sviluppare protocolli per funzionalizzare +la superficie di sfere dielettriche e legarci le molecole che +intendiamo studiare. Tipicamente esperimenti di questo tipo vengono realizzati utilizzando sfere dielettriche di dimensioni micrometriche funzionalizzate legando -covalentemente molecole di \textit{streptavidina} alla loro superificie. +covalentemente molecole di \textit{streptavidina} alla loro +superificie. In questo modo è possibile successivamente ottenere il legame delle microsfere col polimero biologico d'interesse, purché esso sia stato preventivamente biotilinato. Si sfrutta in questo modo il legame -streptavidina-biotina, estremamente stabile e praticamente irreversibile -(vedi figura \ref{fig:biotin-streptavidin}). +streptavidina-biotina, estremamente stabile e praticamente +irreversibile (vedi figura \ref{fig:biotin-streptavidin}). \begin{figure}[ht] \centering \includegraphics[width=0.5\linewidth]{images/biotin-streptavidin.pdf} \caption{Manipolazione di una proteina target utilizzando una - microsfera intrappolata e il legame biotina-streptavidina.} + microsfera intrappolata e il legame biotina-streptavidina.} \label{fig:biotin-streptavidin} \end{figure} @@ -336,10 +370,11 @@ In generale la forza a cui è soggetta la microsfera interagente col campo elettromagnetico può essere scomposta in due contributi: \begin{itemize} - \item La \textbf{forza di \textit{scattering}} o pressione di radiazione, sempre orientata nella direzione di propagazione - della radiazione e proporzionale alla sua intesità. + \item La \textbf{forza di \textit{scattering}} o pressione di + radiazione, sempre orientata nella direzione di propagazione + della radiazione e proporzionale alla sua intesità. \item La \textbf{forza di dipolo} o gradiente, proporzionale - al gradiente d'intensità della radiazione elettromagnetico. + al gradiente d'intensità della radiazione elettromagnetico. \end{itemize} L'origine di questi due contributi e la dipenza dalle caratteristiche @@ -350,7 +385,8 @@ inferiori alla lunghezza d'onda della radiazione utilizzata. In questo limite possiamo considerare il materiale interagente con la radiazione come un dipolo elettrico puntiforme, associato ad una -polarizzabilità $\alpha$. Il vettore di polarizzazione nel dipolo puntiforme sarà quindi $\vec{p} = \alpha \vec{E}$. +polarizzabilità $\alpha$. Il vettore di polarizzazione nel dipolo +puntiforme sarà quindi $\vec{p} = \alpha \vec{E}$. La pressione di radiazione sarà quindi proporzionale all'impulso dei fotoni retrodiffusi per \textit{scattering} Rayleigh. @@ -365,67 +401,79 @@ immersa in un fluido con indice di rifrazione $m$, la forza di \right)^2 \end{equation} -L'espressione della forza gradiente può essere ottenuta dall'interazione -lorentziana tra la radiazione e il dipolo puntiforme: -L +L'espressione della forza gradiente può essere ottenuta +dall'interazione lorentziana tra la radiazione e il dipolo puntiforme: + $$ \vec{F}_g = - \left( \vec{p} \cdot \vec{\nabla} \right) \vec{E} - + \frac{d\vec{p}}{dt} \times \vec{B} + \left( + \vec{p} \cdot \vec{\nabla} + \right) + \vec{E} + + \frac{d\vec{p}}{dt} \times \vec{B} $$ Ovvero, una volta sostituito il vettore di polarizzazione: -$$ \vec{F}_g = \alpha -\left[ - \left( \vec{E} \cdot \vec{\nabla} \right) \vec{E} - + \frac{d\vec{E}}{dt} \times \vec{B} -\right] +$$ \vec{F}_g = + \alpha + \left[ + \left( \vec{E} \cdot \vec{\nabla} \right) \vec{E} + + \frac{d\vec{E}}{dt} \times \vec{B} + \right] $$ -E infine, tenendo conto delle \emph{equazioni di Maxwell} e dell'algebra dei vettori: +E infine, tenendo conto delle \emph{equazioni di Maxwell} e +dell'algebra dei vettori: \begin{equation} \label{dipole_force} -\vec{F_g} -= \alpha -\left[ - \frac{1}{2}\nabla E^2 - + \frac{d}{dt}\left(\vec{E} \times \vec{B}\right) -\right] +\vec{F_g} = + \alpha + \left[ + \frac{1}{2}\nabla E^2 + + \frac{d}{dt}\left(\vec{E} \times \vec{B}\right) + \right] \end{equation} -Questa ultima forma (equazione \ref{dipole_force}) ci permette di mettere in evidenza il termine $\frac{d}{dt}(\vec{E} \times \vec{B})$, ovvero la derivata temporale di una quantità oscillante molto rapidamente (\SI{> 1e14}{\Hz}), che -può tranquillamente essere considerata costante se confrontata con in tempi -tipici dell'evoluzione meccanica del sistema. Il secondo termine può quindi -essere trascurato e, sostituendo ad $\alpha$ l'espressione per la polarizzabilità -della microsfera otteniamo: +Questa ultima forma (equazione \ref{dipole_force}) ci permette di +mettere in evidenza il termine $\frac{d}{dt}(\vec{E} \times \vec{B})$, +ovvero la derivata temporale di una quantità oscillante molto +rapidamente (\SI{> 1e14}{\Hz}), che +può tranquillamente essere considerata costante se confrontata con in +tempi tipici dell'evoluzione meccanica del sistema. +Il secondo termine può quindi essere trascurato e, sostituendo ad +$\alpha$ l'espressione per la polarizzabilità della microsfera +otteniamo: \begin{equation} - \vec{F}_g = +\vec{F}_g = \frac{2\pi n a^3}{c} \left( - \frac{(n/m)^2 - 1}{(n/m)^2 + 2} + \frac{(n/m)^2 - 1}{(n/m)^2 + 2} \right) \nabla I(\vec{r}) \end{equation} -Il risultato netto dei due contributi è che la microsfera tendera ad occupare una -posizione di equilibrio nel punto in cui i due contributi si cancellano e, se -perturbata, risentirà di una forza di richiamo verso la posizione di equilibrio. +Il risultato netto dei due contributi è che la microsfera tenderà ad +occupare una posizione di equilibrio nel punto in cui i due contributi +si cancellano e, se perturbata, risentirà di una forza di richiamo +verso la posizione di equilibrio. -Un risultato qualitativamente identico è dimostrabile nel limite dell'ottica -geometrica, quando la particella è al contrario di dimensioni molto maggiori -alla lunghezza d'onda intermedia. +Un risultato qualitativamente identico è dimostrabile nel limite +dell'ottica geometrica, quando la particella è al contrario di +dimensioni molto maggiori alla lunghezza d'onda intermedia. -Il caso intermedio richiede l'uso della più complessa teoria Lorenz-Mie e spesso -il ricorso a soluzioni numeriche, ma l'idea qualitativa alla base -dell'intrappolamento resta valida. +Il caso intermedio richiede l'uso della più complessa teoria +Lorenz-Mie e spesso il ricorso a soluzioni numeriche, ma l'idea +qualitativa alla base dell'intrappolamento resta valida. -Nel caso generale i requisiti per un intrappolamento efficace sono quelli di avere -una forza di gradiente maggiore di quella di scattering e una energia cinetica -delle particelle intrappolate sufficientemente bassa (quindi un fluido sufficientemente viscoso). +Nel caso generale i requisiti per un intrappolamento efficace sono +quelli di avere una forza di gradiente maggiore di quella di +scattering e una energia cinetica delle particelle intrappolate +sufficientemente bassa (quindi un fluido sufficientemente viscoso). -Per le nostre applicazioni è sufficiente considerare una forza di richiamo del tipo +Per le nostre applicazioni è sufficiente considerare una forza di +richiamo del tipo \begin{equation} \vec{F} = -k(\vec{x}-\vec{x}_{eq}) @@ -438,23 +486,29 @@ Per le nostre applicazioni è sufficiente considerare una forza di richiamo del \label{fig:fkx} \end{figure} -Il valore di $k$ per una certa trappola ottica, come vedremo, può essere -determinato attraverso un'apposita procedura di calibrazione che sfrutta -la diffusione della microsfera all'interno della trappola. +Il valore di $k$ per una certa trappola ottica, come vedremo, può +essere determinato attraverso un'apposita procedura di calibrazione +che sfrutta la diffusione della microsfera all'interno della trappola. -Inoltre è necessario considerare l'effetto degli urti con le molecole della -soluzione liquida in cui la sfera è immersa, che hanno i due seguenti effetti: +Inoltre è necessario considerare l'effetto degli urti con le molecole +della soluzione liquida in cui la sfera è immersa, che hanno i due +seguenti effetti: \begin{itemize} - \item La presenza di un attrito viscoso, proporzionale alla velocità relativa - della sfera rispetto al fluido - \item La fluttuazione della sfera rispetto alla posizione di equilibrio (moto browniano). + \item La presenza di un attrito viscoso, proporzionale alla + velocità relativa della sfera rispetto al fluido + \item La fluttuazione della sfera rispetto alla posizione di + equilibrio (moto browniano). \end{itemize} -Grazie alla termodinamica statistica è possibile mettere in relazione lo spettro -delle fluttuazioni di posizione di una sfera intrappolata con il parametro $k$ della -forza elastica di richiamo (vedi Appendice \ref{}). In questo modo, una volta determinato $k$, è possibile mettere -in relazione il valore delle forze esterne agenti sulla sfera con il suo spostamento dalla -posizione di riposo. +Grazie alla termodinamica statistica è possibile mettere in relazione +lo spettro delle fluttuazioni di posizione di una sfera intrappolata +con il parametro $k$ della forza elastica di richiamo +(vedi Appendice \ref{}). +In questo modo, una volta determinato $k$, è possibile mettere +in relazione il valore delle forze esterne agenti sulla sfera con il +suo spostamento dalla posizione di riposo. + +\section{Microscopia di fluorescenza di singola molecola} -\section{Microscopia di fluorescenza} \ No newline at end of file +Le microscopia di fluorescenza \ No newline at end of file diff --git a/references.bib b/references.bib index 9369929..acc9044 100644 --- a/references.bib +++ b/references.bib @@ -1,32 +1,32 @@ @article{Ashkin:86, -author = {A. Ashkin and J. M. Dziedzic and J. E. Bjorkholm and Steven Chu}, -journal = {Opt. Lett.}, -keywords = {Laser beams; Optical trapping; Optical tweezers; Particle scattering; Radiation pressure; Scattering}, -number = {5}, -pages = {288--290}, -publisher = {OSA}, -title = {Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles}, -volume = {11}, -month = {May}, -year = {1986}, -url = {http://ol.osa.org/abstract.cfm?URI=ol-11-5-288}, -doi = {10.1364/OL.11.000288}, -abstract = {Optical trapping of dielectric particles by a single-beam gradient force trap was demonstrated for the first reported time. This confirms the concept of negative light pressure due to the gradient force. Trapping was observed over the entire range of particle size from 10 $\mu$m to ~25 nm in water. Use of the new trap extends the size range of macroscopic particles accessible to optical trapping and manipulation well into the Rayleigh size regime. Application of this trapping principle to atom trapping is considered.}, + author = {A. Ashkin and J. M. Dziedzic and J. E. Bjorkholm and Steven Chu}, + journal = {Opt. Lett.}, + keywords = {Laser beams; Optical trapping; Optical tweezers; Particle scattering; Radiation pressure; Scattering}, + number = {5}, + pages = {288--290}, + publisher = {OSA}, + title = {Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles}, + volume = {11}, + month = {May}, + year = {1986}, + url = {http://ol.osa.org/abstract.cfm?URI=ol-11-5-288}, + doi = {10.1364/OL.11.000288}, + abstract = {Optical trapping of dielectric particles by a single-beam gradient force trap was demonstrated for the first reported time. This confirms the concept of negative light pressure due to the gradient force. Trapping was observed over the entire range of particle size from 10 $\mu$m to ~25 nm in water. Use of the new trap extends the size range of macroscopic particles accessible to optical trapping and manipulation well into the Rayleigh size regime. Application of this trapping principle to atom trapping is considered.}, } @article{HARADA1996529, -title = "Radiation forces on a dielectric sphere in the Rayleigh scattering regime", -journal = "Optics Communications", -volume = "124", -number = "5", -pages = "529 - 541", -year = "1996", -issn = "0030-4018", -doi = "https://doi.org/10.1016/0030-4018(95)00753-9", -url = "http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0030401895007539", -author = "Yasuhiro Harada and Toshimitsu Asakura", -abstract = "Theoretical expressions of the radiation pressure force for a dielectric sphere in the Rayleigh regime of light scattering under illumination of a Gaussian laser beam with the fundamental mode are derived in explicit form as a function of measurable quantities of the beam parameter in MKS units. Correctness of the derived expressions and validity of the size range of the Rayleigh approximation for the radiation forces as a sum of the scattering force and the gradient force are investigated by a graphical comparison of the calculated forces in longitudinal and transverse components with those obtained from the generalized Lorenz-Mie theory. Fairly good agreement in both components is found within ordinary particle-size ranges of the Rayleigh scattering theory. Furthermore, the good agreement in the transverse component, where the gradient force is dominant, is found to be satisfactory beyond the existing criterion in particle size of the Rayleigh scattering theory until the particle size becomes comparable with the spot size of the illuminating laser beam." + title = "Radiation forces on a dielectric sphere in the Rayleigh scattering regime", + journal = "Optics Communications", + volume = "124", + number = "5", + pages = "529 - 541", + year = "1996", + issn = "0030-4018", + doi = "https://doi.org/10.1016/0030-4018(95)00753-9", + url = "http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0030401895007539", + author = "Yasuhiro Harada and Toshimitsu Asakura", + abstract = "Theoretical expressions of the radiation pressure force for a dielectric sphere in the Rayleigh regime of light scattering under illumination of a Gaussian laser beam with the fundamental mode are derived in explicit form as a function of measurable quantities of the beam parameter in MKS units. Correctness of the derived expressions and validity of the size range of the Rayleigh approximation for the radiation forces as a sum of the scattering force and the gradient force are investigated by a graphical comparison of the calculated forces in longitudinal and transverse components with those obtained from the generalized Lorenz-Mie theory. Fairly good agreement in both components is found within ordinary particle-size ranges of the Rayleigh scattering theory. Furthermore, the good agreement in the transverse component, where the gradient force is dominant, is found to be satisfactory beyond the existing criterion in particle size of the Rayleigh scattering theory until the particle size becomes comparable with the spot size of the illuminating laser beam." } @@ -63,17 +63,30 @@ abstract = "Theoretical expressions of the radiation pressure force for a dielec } @article{doi:10.1002/pro.3715, -author = {Kanehisa, Minoru}, -title = {Toward understanding the origin and evolution of cellular organisms}, -journal = {Protein Science}, -volume = {28}, -number = {11}, -pages = {1947-1951}, -keywords = {KEGG, KEGG MEDICUS, KEGG module, pathway mapping, reaction module}, -doi = {10.1002/pro.3715}, -url = {https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pro.3715}, -eprint = {https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/pro.3715}, -abstract = {Abstract In this era of high-throughput biology, bioinformatics has become a major discipline for making sense out of large-scale datasets. Bioinformatics is usually considered as a practical field developing databases and software tools for supporting other fields, rather than a fundamental scientific discipline for uncovering principles of biology. The KEGG resource that we have been developing is a reference knowledge base for biological interpretation of genome sequences and other high-throughput data. It is now one of the most utilized biological databases because of its practical values. For me personally, KEGG is a step toward understanding the origin and evolution of cellular organisms.}, -year = {2019} + author = {Kanehisa, Minoru}, + title = {Toward understanding the origin and evolution of cellular organisms}, + journal = {Protein Science}, + volume = {28}, + number = {11}, + pages = {1947-1951}, + keywords = {KEGG, KEGG MEDICUS, KEGG module, pathway mapping, reaction module}, + doi = {10.1002/pro.3715}, + url = {https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/pro.3715}, + eprint = {https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1002/pro.3715}, + abstract = {Abstract In this era of high-throughput biology, bioinformatics has become a major discipline for making sense out of large-scale datasets. Bioinformatics is usually considered as a practical field developing databases and software tools for supporting other fields, rather than a fundamental scientific discipline for uncovering principles of biology. The KEGG resource that we have been developing is a reference knowledge base for biological interpretation of genome sequences and other high-throughput data. It is now one of the most utilized biological databases because of its practical values. For me personally, KEGG is a step toward understanding the origin and evolution of cellular organisms.}, + year = {2019} } +@article{Capitanio2012, + doi = {10.1038/nmeth.2152}, + url = {https://doi.org/10.1038/nmeth.2152}, + year = {2012}, + month = sep, + publisher = {Springer Science and Business Media {LLC}}, + volume = {9}, + number = {10}, + pages = {1013--1019}, + author = {Marco Capitanio and Monica Canepari and Manuela Maffei and Diego Beneventi and Carina Monico and Francesco Vanzi and Roberto Bottinelli and Francesco Saverio Pavone}, + title = {Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke}, + journal = {Nature Methods} +} \ No newline at end of file