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chapters/3-methods.tex

@@ -66,8 +66,8 @@ alla quota del piano focale rispetto al  centro della sfera.
 Il metodo sviluppato sfrutta le caratteristiche dalla distribuzione
 radiale della luce diffusa dalla microsfera.
 
-In figura \ref{fig:radial_itensity} rappresentato l'andamento del profilo radiale variando
-la quota del piano focale (z).
+In figura \ref{fig:radial_itensity} rappresentato l'andamento del
+profilo radiale variando la quota del piano focale (z).
 
 \begin{figure}[h]
     \centering
@@ -82,11 +82,83 @@ integrata nella regione interna al medesimo anello (regioni gialle
 e arancioni in figura), mostra un andamento proporzionale alla quota
 del piano focale, almeno in un certo intorno del centro della sfera.
 
+In figura \ref{fig:z_est} viene mostrato l'andamento del rapporto
+tra l'intensità media in un anello con raggio interno ed esterno
+rispettivamente di \SIlist{80;160}{pixel} e l'intensità media
+calcolata in un raggio di \SI{60}{pixel}.
+
+\begin{figure}[h]
+     \centering
+     \includegraphics{images/z-est.pdf}
+     \caption{Andamento del rapporto intensità anello/cerchio in
+     funzione della quota del piano focale.}
+     \label{fig:z_est}
+\end{figure}
  
+Come si può osservare la quantità così definita può essere usata
+per determinare la quota con una discreta sensibilità in
+un intervallo di \SIrange{3}{4}{\um} intorno al centro della sfera.
+Analogamente a quanto fatto per le assi x e y è possibile eseguire
+una calibrazione spostando il campione di una quota controllata
+attraverso il traslatore piezoelettrico dell'obiettivo, e costruire
+una curva di calibrazione come quella in figura \ref{fig:z_est}.
+
+Conoscendo quindi tre fattori di calibrazione è possibile, partendo
+da un'immagine della microsfera, ottenere una stima della sua
+posizione nello spazio tridimensionale. Questo fatto ci permette
+di implementare un sistema attivo di stabilizzazione meccanica del
+microscopio. Continuando a monitorare la sfera mediante mentre si
+eseguono le misurazioni di forza è possibile rilevare gli spostamenti
+del campione e compensarli inviando appositi comandi ai traslatori
+piezoelettrici.
+
+In ambiente LabVIEW è stato sviluppato un codice di controllo
+che implementa un meccanismo di retroazione tra le letture sulla
+posizione della sfera e i traslatori piezoelettrici.
+Il codice consente all'operatore di selezionare la regione
+d'interesse intorno a una microsfera immobilizzata sul vetrino
+coprioggetti. Successivamente, quando la stabilizzazione viene
+attivata, il codice acquisice diverse immagini della microsfera e
+ne stima la posizione iniziale in termini di coordinate (x, y, z),
+usando i fattori di conversione determinati con la calibrazione.
+A questo punto viene avviato un ciclo di retroazione: continuando
+a acquisire immagini della microsfera (a una frequenza che può
+arrivare fino a \SI{100}{\Hz}), viene comandato ai traslatori
+uno spostamento proporzionale alla differenza tra la posizione della
+sfera rilevata e quella iniziale.
+
+Quando il sistema di stabilizzazione meccanica viene attivato
+è stato possibile mostrare che la posizione media del campione resta
+stabile indipendentemente dal tempo di osservazione, con fluttuazione
+che hanno una deviazione standard di circa \SI{1}{\nm}.
+Introdurre nel ciclo di controlla alla componente proporzionale
+una componente integrale o derivativa non altera significativamente
+la stabilizzazione raggiunta. 
+
+L'acquisizione di diverse tracce della durata di 5-10 minuti ha
+sempre mostrato deviazioni standard delle fluttuazioni comprese
+tra \SIlist{1;2}{\nm}.
+
+
  
  \section{Calibrazione parametri trappole}
  \label{sec:calibration}
  
+ Per poter eseguire misurazioni di forza su sistemi biologici è
+ fondamentale riuscire a conoscere il valore della tensione applicata
+ alle microsfere intrappolate nelle pinzette ottiche. Questo è
+ possibile dal momento che l'azione di una pinzetta ottica su una
+ microsfera può essere modellizzata come una forza di richiamo
+ elastica (vedi sezione \ref{sec:ot}).
+ 
+ Conoscendo la costante di richiamo è possibile mettere in relazione
+ la posizione della sfera rispetto al centro della trappola
+ (rilevabile tramite i QPD) con la risultante delle altre forze
+ esterne che agiscono sulla microsfera.
+ 
+ 
+ 
+
  \section{Retroazione AOM e \textit{force-clamp}}
  \label{sec:force-clamp}
  

chapters/A3-protocols.tex

@@ -2,7 +2,7 @@
 \label{app:protocols}
 
 \begin{algorithm}[h]
-\caption{Microsfere di silice in nitrocellulosa}
+\caption{Microsfere di silice in nitrocellulosa \cite{Monico2014}}
 \label{proto:silica_beads}
 \begin{tabular}{p{2cm} p{12cm}}
      \textbf{Materiale \mbox{necessario}:}
@@ -16,16 +16,16 @@
          $\bullet$~Acetone
 \end{tabular}
 \begin{algorithmic}[1]
-    \STATE Preparare \SI{1}{\mL} di soluzione di nitrocellulosa dissolta in
-    acetato di pentile, concentrazione \SI{0.1}{\percent}. 
-    \STATE Diluire \SI{20}{\uL} di microsfere in silice in \SI{1}{\mL} di
-    acetone, sonicare per \SI{30}{\second} e vortexare.
+    \STATE Preparare \SI{1}{\mL} di soluzione di nitrocellulosa
+        dissolta in acetato di pentile, concentrazione \SI{0.1}{\percent}. 
+    \STATE Diluire \SI{20}{\uL} di microsfere in silice in
+        \SI{1}{\mL} di acetone, sonicare per \SI{30}{\second} e
+        vortexare.
     \STATE Centrifugare per \SI{2}{\minute} a \SI{19000}{g}.
-    \STATE Ripetere il lavaggio precedente sempre con 1mL di acetone.
+    \STATE Ripetere il lavaggio precedente sempre con \SI{1}{\mL} di acetone.
     \STATE Ripetere il lavaggio precedente due volte con acetato di
     pentile.
-    \STATE Risospendere infine nella soluzione di nitrocellulosa in
-    acetato di pentile (\SI{0.1}{\percent}).
+    \STATE Risospendere infine nella soluzione di nitrocellulosa in    acetato di pentile (\SI{0.1}{\percent}).
     \STATE Conservare a \SI{4}{\celsius} e usare entro un mese.
 \end{algorithmic}
 \end{algorithm}
@@ -39,7 +39,7 @@ immobilizzate}
      & 
          $\bullet$~Soluzione con microsfere in nitrocellulosa
             (vedi Protocollo \ref{proto:silica_beads})
-         $\bullet$~Acqua ultrapura Milli-Q®
+         $\bullet$~Acqua ultrapura Milli-Q\textsuperscript{®}
          $\bullet$~Vetrino portaoggetti
          $\bullet$~Vetrini coprioggetti \#0 (spessore \SI{100}{\um}) 
          $\bullet$~Foglio biadesivo (spessore $\approx \SI{60}{\um}$)

references.bib

@@ -163,4 +163,16 @@
   publisher = {Cold Spring Harbor Laboratory},
   author = {Ekaterina Vasileva and Florian Rouaud and Domenica Spadaro and Wenmao Huang and Adai Colom and Arielle Flinois and Jimit Shah and Vera Dugina and Christine Chaponnier and Sophie Sluysmans and Isabelle M{\'{e}}an and Lionel Jond and Aur{\'{e}}lien Roux and Jie Yan and Sandra Citi},
   title = {Cingulin unfolds {ZO}-1 and organizes myosin-2B and $\upgamma$-actin to mechanoregulate apical and tight junction membranes}
+}
+
+@article{Monico2014,
+  doi = {10.3791/51446},
+  url = {https://doi.org/10.3791/51446},
+  year = {2014},
+  month = aug,
+  publisher = {{MyJove} Corporation},
+  number = {90},
+  author = {Carina Monico and Gionata Belcastro and Francesco Vanzi and Francesco S. Pavone and Marco Capitanio},
+  title = {Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-{DNA} Interactions},
+  journal = {Journal of Visualized Experiments}
 }

titlepage.tex

@@ -48,13 +48,6 @@
             \fontsize{16}{0}\selectfont
             Marco Capitanio
             
-            \vspace{15pt}
-            \fontsize{14}{0}\selectfont
-            \textbf{Correlatore}
-            
-            \vspace{5pt}
-            \fontsize{16}{0}\selectfont
-            Nome Cognome
             
             \vspace{15pt}
             \fontsize{14}{0}\selectfont