From 690c29d6ec32d73536e8f44eddfcc005da605d6d Mon Sep 17 00:00:00 2001 From: "lorenzo.zolfanelli93" Date: Thu, 13 Aug 2020 20:05:11 +0000 Subject: [PATCH] Update on Overleaf. --- chapters/1-introduction.tex | 60 +++++++++++++++++++++++++++++++++++-- 1 file changed, 57 insertions(+), 3 deletions(-) diff --git a/chapters/1-introduction.tex b/chapters/1-introduction.tex index 22f8337..06ae4be 100644 --- a/chapters/1-introduction.tex +++ b/chapters/1-introduction.tex @@ -557,6 +557,60 @@ proteine contenenti regioni fluorescenti. I fluorofori utilizzati possono essere piccole molecole organiche, nanoparticelle realizzate in materiali semiconduttori (come i punti quantici) oppure sequenze di amminoacidi. - -Per la produzione delle immagini esistono due macrocategorie di -tecniche: +In commercio si trovano numerosi fluorofori operanti in molteplici +regioni dello spettro visibile e con protocolli di marcatura +standardizzati. La scelta del fluoroforo e del protocollo di marcatura +devono tener conto di numerosi fattori, tra i quali: le condizioni +dell'esperimento (in vivo o in vitro), le possibili interferenze col +comportamento del sistema studiato, la compatibilità con le sostanza +chimiche usate in soluzione, la stabilità del fluoroforo stesso e il +suo tempo di vita. + +Per la produzione delle immagini esistono due macro-categorie di +tecniche: le microscopie a campo largo (o \textit{wide-field}) e +le miscroscopie a scansione puntiforme. +Nel primo caso l'intero volume osservato viene illuminato +uniformemente e la radiazione emessa per fluorescenza viene raccolta +e ingrandita da un opportuno cammino ottico che ricostruisce +l'immagine sulla matrice di un sensore CMOS o CCD. +Nel secondo caso l'area di interesse viene suddivisa in un reticolo +tridimensionale di punti e ogni punto viene acquisito sequenzialmente, +illuminando il più piccolo volume circostante possibile e raccogliendo +tutta la radiazione emessa proveniente dal medesimo volume in un +unico punto, coincidente con l'apertura di un fotodiodo o di un +fotomoltiplicatore. + +Il principale vantaggio delle tecniche a scansione rispetto a quelle +a campo largo risiede in una più marcata soppressione del +rumore di fondo dovuto all'emissione di fluorescenza fuori dal +piano focale. I microscopi che sfruttano queste tecniche sono infatti +equipaggiati di opportuni accorgimenti per filtrare sia la radiazione +di eccitazione che quella raccolta in modo da selezionare uno strato +estremamente sottile del volume del campione. +Le dimensioni del volume selezionato per ogni +punto acquisito posso avvicinarsi molto al limite di diffrazione, e +in questo modo è possibile visualizzare in maniera estremamente nitida +strutture con dettagli di dimensioni confrontabili con il limite +di diffrazione, +Lo svantaggio principale invece sta nella massima risoluzione +temporale ottenibile: per acquisire un'immagine è necessario +muovere il campione (o il fascio di illuminazione) attraverso +l'intero reticolo e per ogni punto è necessario un tempo di sosta +adeguato a raccogliere un numero sufficiente di fotoni. +La risoluzione temporale di un microscopio a scansione quindi, +decresce all'aumentare delle dimensioni dell'area osservata e della +densità di punti acquisita. + +La microscopia a campo largo, acquisendo simultaneamente tutto il +fotogramma in una sola volta, consente di raggiungere risoluzioni +temporali molto elevate anche per campioni estesi. La velocità +di acquisizione di un singolo fotogramma è essenzialmente limitata +dalla sensibilità del sensore usato e dalla velocità della sua scheda +elettronica. +Tuttavia, in questo caso, sul sensore si va a sommare all'immagine +proveniente dai fluorofori nel piano focale quella, fuori fuoco, +di tutti gli emettitori che si trovino su piani diversi attraversati +dal fascio. +In campioni con una elevata densità di fluorofori liberi in soluzione +questo effetto viene particolarmente accentuato, con un effetto +negativo sul rapporto segnale/rumore ottenibile. \ No newline at end of file