diff --git a/chapters/1-introduction.tex b/chapters/1-introduction.tex index b72beb5..4c7ec12 100644 --- a/chapters/1-introduction.tex +++ b/chapters/1-introduction.tex @@ -40,32 +40,59 @@ ad esempio come questi posssano modulare l'interazione tra due proteine diverse. La teoria alla base del loro funzionamento è introdotta nella sezione \ref{sec:ot}. -Quando sono combinate con tecniche ultraveloci per il posizionamento -delle trappole e il rilevamento degli spostamenti degli oggetti -intrappolati le pinzette ottiche consentono la realizzazione di -esperimenti di \emph{spettroscopia force-clamp}, approfonditi nella +Per indagare la dinamica delle interazioni tra due +macromolecole (proteine) soggette a stimoli meccanici +è possibile eseguire esperimenti di spettroscopia +\textit{force-clamp}, ottimizzando il sistema per +mantenere sulle +molecole una tensione costante ed osservare il tempo di +vita delle interazioni. +Quando queste interazioni sono molto rapide e +intermittenti è necessario che le pinzette ottiche siano +combinate con tecniche ultraveloci per il posizionamento +delle trappole e il rilevamento degli spostamenti degli oggetti intrappolati. L'idea alla base di questi +esperimenti e alcuni esempi sono illustarti in sezione \ref{sec:force_clamp}. -Parallelamente la microscopia ottica ha permesso di descrivere i -processi biologici con una precisione sempre maggiore, rendendo -possibile la rilevazione e il tracciamento di singole molecole. -In particolare nell'ambito della microscopia di fluorescenza sono -state sviluppate tecniche per ricostruire immagini superando il -\emph{limite di diffrazione}, per indurre la produzione di proteine -fluorescenti grazie all'ingegneria genetica, per rendere rilevabile -il segnale di singoli fluorofori immobilizzati sopprimendo il rumore -di quelli liberi in soluzione. -La teoria alla base di alcune di queste techniche è introdotta -nella sezione \ref{sec:imaging}, andando ad indagare -la dinamica di interazione -Lo scopo di questa tesi è combinare un sistema di \emph{spettroscopia force-clamp} con un sistema di \emph{imaging di singola molecola} per l'esecuzione di misure in vitro simultanee e sincronizzate. +Fino a ora il principale limite di questi esperimenti è +stato quello di produrre informazioni dinamiche +esclusivamente sui due componenti interagenti selezionati, +trascurando ogni altra possibile interazione. +Se in diversi scenari questo è più che sufficiente, alcuni +sistemi biologici, come le giunzioni cellulari, sono formati da un gran numero di diverse proteine mutualmente +interagenti. + +L'idea alla base di questa tesi è di osservare, durante +un esperimento di spettroscopia \textit{force-clamp} in +cui viene applicata una tensione e studiata l'interazione +tra due proteine appartenenti ad una giunzione cellulare, +la dinamica dell'interazione con altri fattori che potrebbero svolgere un ruolo importante nella trasduzione dei segnali meccanici. + +La strategia scelta per ottenere questo prevede +di inserire questi fattori aggiunti alla cella di reazione +per l'esperimento \textit{force-clamp}, opportunamente +marcati con fluorofori, e di utilizzare opportune +tecniche di microscopia di fluorescenza per rilevare +l'interazione di questi fattori liberi in soluzione +con le proteine immobilizzate. +L'ostacolo principale al raggiungimento di questo +risultato è dato dalla difficoltà di visualizzare, +tramite microscopia ottica, l'attività di una singola +molecola fluorescente legata sopra un fondo di fluorofori +liberi in soluzione. Per questo motivo è necessario +utilizzare tecniche che garantiscano un'elevata +soppressione del rumore di fondo, come la microscopia +a riflessione interna totale (TIRF, \textit{Total Interal Reflection Fluorescence microscopy}) o la microscopia +a fogli di luce laminari altamente inclinati (HILO, \textit{Higly Inclined and Laminated Optical sheet microscopy}). Queste tecniche insieme alle basi della +microscopia di fluorescenza sono descritte nella +sezione \ref{sec:fluo}. -In questo modo sarà possibile studiare, in un ambiente -controllato (proteine in soluzione e immobilizzate su microsfere), -il comportamento di proteine \emph{meccano-sensibili}, unendo alle -informazioni meccaniche quelle sulla dinamica di interazione -con altri fattori opportunamente marcarti presenti in soluzione. +In questo modo sarà possibile studiare, in un ambiente +controllato (proteine in soluzione e immobilizzate su microsfere), la complessa rete di interazioni che governa +il funzionamento delle giunzioni cellulari, aggiungendo +all'informazione \emph{meccanica} su due proteine soggette +a tensione esterna quella sull'attivaziono o disattivazione del legame con gli altri fattori coinvolti. % Introduction on the importance of mechanotransduction @@ -78,6 +105,19 @@ con altri fattori opportunamente marcarti presenti in soluzione. % between +\section{Giunzioni cellulari} +\label{sec:giunzioni} + +Le giunzioni cellulari svolgono un ruolo estremamente +importante nell'organizzazione dei tessuti degli org + +\begin{figure}[ht] + \centering + \includegraphics[width=0.5\linewidth]{images/adjunc.pdf} + \caption{Sequenza di cellule connesse da \emph{giunzioni aderenti} (sopra) e dettaglio di una giunzione aderente, con indicazione delle principali proteine coinvolte (sotto)} + \label{fig:my_label} +\end{figure} + \section{Pinzette ottiche} \label{sec:ot} diff --git a/images/adjunc.pdf b/images/adjunc.pdf new file mode 100644 index 0000000..b35d338 Binary files /dev/null and b/images/adjunc.pdf differ diff --git a/images_src/adjunc.svg b/images_src/adjunc.svg new file mode 100644 index 0000000..b7907af --- /dev/null +++ b/images_src/adjunc.svg @@ -0,0 +1,3797 @@ + +image/svg+xml + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +Filamentidi actina + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +Vinculina + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +Giunzioni aderenti(Zonula adherens) + + + + +ActinaMembrana plasmaticaCateninaα-actininaCaderina