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- \chapter{Metodi}
- \label{cap:methods}
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- \section{Stabilizzazione meccanica}
- \label{sec:stabilization}
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- Nonostante l'isolamento meccanico fornito dagli elastomeri e dal
- tavolo ottico la posizione del campione rispetto al centro
- dell'obiettivo e la quota del piano focale sono soggette a
- fluttuazioni e derive.
- Gli effetti più evidenti e rilevabili sono rapide oscillazioni della
- posizione del campione dovute a vibrazioni acustiche residue e una
- progressive deriva rispetto alla posizione fissata che diventa
- significativa ($> \SI{100}{\nm}$) per tempi di osservazione di
- diversi minuti.
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- Per quantificare quest'effetto viene usato un apposito campione in cui
- diverse microsfere in silice, di diametro \SI{0.5}{\um}, vengono
- immobilizzate in uno strato di nitrocellulosa depositato nella
- superficie interna del vetrino coprioggetti.
- Le varie fasi per la preparazione di questo campione sono descritte
- nei particolari nell'appendice \ref{app:protocols}, protocollo
- \ref{proto:silica_beads_flow_cell}.
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- Le microsfere immobilizzate nel campione possono essere messe a fuoco
- e visualizzate attraverso il sistema di microscopia a luce trasmessa.
- Una volta selezionata e messa a fuoco una microsfera, analizzando
- l'immagine prodotta da uno dei due sensori CMOS è possibile calcolare
- le coordinate (in pixel) del suo centroide:
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- \begin{equation}
- (x_{cen}, y_{cen}) =
- \frac{
- \sum_{(x, y)} (x, y) I(x, y)
- }{
- \sum_{(x, y)} I(x, y)
- }
- \end{equation}
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- Per evitare di considerare altre microsfere o imperfezioni sul campione
- si sceglie di effettuare il calcolo del centroide limitando la regione
- dell'immagine utilizzata a un rettangolo nel quale una microsfera è
- sufficientemente isolata.
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- Ricalcolando il centroide intervalli temporali fissati è possibile
- osservare la deriva della posizione (x, y) della microsfera.
- Inoltre è possibile sfruttare questo stesso campione per effettuare
- una calibrazione del fattore di conversione pixel/nm lungo due assi
- ortogonali.
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- Per effettuare la calibrazione, dopo aver calcolato il centroide
- della microsfera, si sposta la posizione dal campione lungo uno dei
- due assi di una distanza ben definita, utilizzando il traslatore
- piezoelettrico. A questo punto, calcolando la nuova posizione del
- centroide si ottiene il rapporto tra lo spostamento comandato al
- traslatore (in \si{\nm}) e la variazione del centroide (in pixel).
- Ripetendo questa operazione in sequenza per vari punti si ottiene
- una curva di calibrazione per l'asse scansionata, dalla quale è
- possibile estratte la costante di proporzionalità con un \textit{fit}
- lineare.
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- Risulta più complesso invece stimare la deriva del piano focale:
- per questo motivo è stato sviluppato
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- \section{Calibrazione parametri trappole}
- \label{sec:calibration}
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- \section{Retroazione AOM e \textit{force-clamp}}
- \label{sec:force-clamp}
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- \section{Saggio a tre sfere}
- \label{sec:three-beads}
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- \section{Fluorescenza di singola molecole}
- \label{sec:single_molecule_fluorescence}
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- \section{TIRF e illuminazione a modi di galleria}
- \label{sec:gallery_mode}
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