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\chapter{Apparato sperimentale}
\label{cap:methods}

L'apparato sperimentale realizzato consiste in un microscopio
invertito, progettato con la collaborazione dell'Officina Meccanica
del LENS, che combina l'illuminazione a luce trasmessa con un sistema
di due pinzette ottiche posizionabili elettronicamente e con uno
schema di microscopia di epifluorescenza, in grado di raggiungere
la sensibilità di singola molecola e di alternare diversi schemi
di illuminazione (campo largo, TIRF, HILO).

Una rappresentazione schematica del microscopio è mostrata in figura
\ref{fig:microscope}.


 %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%%
Il sistema è ottimizzato per consentire la coesistenza e il
funzionamento simultaneo - senza interferenze - dei tre principali
schemi di microscopia e manipolazione:

\begin{description}
    \item[Illuminazione a luce trasmessa:] la luce emessa da una
        sorgente LED a spettro largo viene collimata da un
        condensatore e trasmessa dall'alto verso il basso attraverso
        il campione.
        L'obiettivo posto sotto il campione raccoglie la luce
        trasmessa e ricostruisce un'immagine ingrandita del
        contrasto di densità dello stesso.
    \item[Pinzette ottiche:] due intensi fasci laser vengono
        collimati sul piano focale posteriore dell'obiettivo,
        quindi focalizzati sul campione. In questo modo possono
        essere usati per intrappolare e manipolare microsfere
        in soluzione. La radiazione laser diffusa che attraversa
        il campione e viene raccolta dal condensatore può essere
        analizzata per monitorare lo stato delle trappole e lo
        spostamento dal centro delle sfere intrappolate.
    \item[Epifluorescenza:] Un fascio laser di eccitazione viene
        focalizzato sul piano focale posteriore dell'obiettivo, e
        quindi trasmesso collimato attraverso il campione. La
        radiazione di fluorescenza emessa all'indietro dal campione
        viene nuovamente raccolta dall'obiettivo e attraverso
        un opportuno specchio dicroico disaccoppiata dal fascio
        di eccitazione.
\end{description}

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics[width=1.1\linewidth]{images/microscope.pdf}
    \caption{Schema delle componenti principali del microscopio e dei percorsi
    ottici utilizzati. A: luce trasmessa, B: pinzette ottiche, C: epifluorescenza.}
    \label{fig:microscope}
\end{figure}

Per evitare interferenze tra i tre schemi è stato necessario
scegliere opportune lunghezze d'onda per la radiazione di
illuminazione e, di conseguenza, appropriati specchi dicroici
e filtri.

L'illuminazione a luce trasmessa è realizzata sfruttando una
sorgente LED con spettro di emissione centrato a \SI{780}{\nm},
le due pinzette ottiche vengono realizzate partendo da un laser
a stato solido Nd:YAG con emissione a \SI{1064}{\nm}. Per la
microscopia di fluorescenza si usano per l'eccitazione sorgenti
laser a diodo alle lunghezze d'onda di \SIlist{488;532;635}{\nm} e
l'emissione dei fluorofori fino a \SI{700}{\nm} può essere raccolta
e disaccopiata dall'illuminazione a luce trasmessa.


\section{Microscopio e traslatori}

Gli elementi ottici e optomeccanici principali che costituiscono
il microscopio sono assemblati su una struttura metallica
personalizzata, realizzata dall'Officina Meccanica del LENS.
Questa struttura è poggiata su un tavolo ottico attraverso quattro
elastomeri termoplastici (Newport NewDamp™) in grado di attenuare
significativamente le vibrazioni meccaniche.
Il tavolo ottico (Melles-Griot) è a sua volta isolato dal pavimento
attraverso un sistema di smorzamento attivo ad aria compressa.

Una miscela in soluzione acquosa delle varie molecole necessarie
per gli esperimenti viene caricata in una camera di reazione
realizzata tra due vetrini (portaoggetti e coprioggetti).
Il preparato così assemblato viene fissato nel microscopio, attraverso
quattro viti, su un tavolino traslatore (il \textit{traslatore corto
raggio} in figura \ref{fig:microscope}), trovandosi quindi tra il 
\textit{condensatore} e l'\textit{obiettivo}.

Per gli scopi di questa tesi sono stati usati due obiettivi
differenti:

\begin{itemize}
    \item Un obiettivo planapocromatico 60x a immersione ad acqua,
        con alta apertura numerica ($NA = 1.22$) e distanza di lavoro
        di \SI{0.2}{\mm} (Nikon)
    \item Un obiettivo TIRF (??) a immersione a olio (Nikon)
\end{itemize}

Il primo obiettivo presenta le caratteristiche migliori per quanto
riguarda l'efficienza delle pinzette ottiche, anche a profondità
significative all'interno del campione.
Il secondo obiettivo invece permette la realizzazione di schemi di
illuminazione TIRF, al prezzo di un'efficienza delle pinzette ottiche
che decresce rapidamente all'aumentare del volume di campione
attraversato.

La posizione del campione rispetto al centro del percorso ottico
può essere modificata attraverso due traslatori controllati
elettronicamente, uno di tipo piezoelettrico (Physik Instrumente, ??)
per spostamenti veloci e con risoluzione nanometrica, con una corsa di
\SI{100}{\um} per asse, e uno di tipo motore passo-passo
(Steinmeyer, KDT105-PM) per spostamenti macroscopici con una corsa di \SI{50}{\mm} per asse.

Il piano focale può essere modificato variando la posizione
dell'obiettivo, grazie a un posizionatore verticale piezoelettrico
(Physik Instrumente, PIFOC™ ??) con con una corsa di \SI{400}{\um}
e risoluzione nanometrica. Il microscopio è stato progettato in modo
che al centro della corsa il piano focale si trovi in corrispondenza
della superficie interna del vetrino portaoggetti (per un campione
preparato nel modo descritto nei paragrafi precedenti).

I posizionatori piezoelettrici per lo stage XY e per l'obiettivo
sono connessi a due moduli elettronici di controllo (rispettivamente
?? e ??) e dotati di sensori che permettono il funzionamento in
modalità a ciclo chiuso. I motori passo-passo del traslatore a lungo
raggio sono invece controllati da un modulo elettronico fornito da
Galil Motion Control e equipaggiati di un \textit{encoder} che
permette la selezione e il monitoraggio della velocità di spostamento.
Le tre unità di controllo sono connesse ad un PC mediante interfaccia
seriale RS232 e possono essere programmate e controllate usando
i protocolli di comunicazione GCS per i moduli Physik Instrumente
e GC \cite{gclib} per il modulo Galil Motion Control.

Per semplificare l'utilizzo dei tre gli attuatori durante
la manipolazione di un campione è stato sviluppato un software
in ambiente LabVIEW che implementa i protocolli di comunicazione
richiesti.
In particolare il software sviluppato consente di utilizzare
levette analogiche e cursori di un \textit{controller} della console
Xbox 360 (Microsoft) per inviare comandi agli attuatori, rendendo la
manipolazione del campione particolarmente semplice e intuitiva.

\section{Illuminazione a luce trasmessa}

La radiazione emessa da un LED ad alta intensità (Thorlabs, M780L3)
con picco di emissione centrato nell'infrarosso, a \SI{780}{nm},
viene filtrata con un filtro passa-basso (Thorlabs, FEHL0750) in modo
da sopprimere l'emissione a lunghezze d'onda inferiori a \SI{750}{nm}
che andrebbe a interferire con il rilevamento della fluorescenza.
Successivamente, con l'ausilio di una singola lente e un accoppiatore
in fibra (Thorlabs), la radiazione emessa dal LED e filtrata
viene immessa in una fibra ottica e trasportata in corrispondenza del
microscopio. All'altra estremità della fibra un sistema formato da un
collimatore, un diaframma e una lente aggiusta le dimensioni e la
divergenza del fascio di illuminazione, direzionandolo collimato verso
il piano focale posteriore del condensatore.
Il fascio di illuminazione viene quindi focalizzato sul campione, lo
attraversa e la radiazione trasmessa e diffusa viene raccolta
dall'obiettivo.
Gli obiettivi usati sono corretti all'infinito, questo significa
che i raggi in uscita dall'obiettivo sono collimati.
Inserendo nel percorso ottico una \textit{lente di tubo} l'immagine
viene messa a fuoco in un piano ben preciso.
La distanza focale dell'obiettivo è di \SI{3.3}{\mm}, quella della
lente di tubo di \SI{250}{\mm}.
Otteniamo quindi la formazione di un immagine del piano del campione
selezionato a una distanza di \SI{250}{\mm} dalla lente e con un 
fattore di ingrandimento $M = 250/3.3 \approx 75$.
Questa immagine viene ulteriormente ingrandita mediante l'uso di
un'ulteriore lente con distanza focale \SI{75}{\mm} posta a
\SI{350}{mm} dalla lente di tubo.
In questo modo si ottiene, a una distanza di \SI{30}{\cm} dall'ultima
lente un ulteriore ingrandimento di un fattore $M' = 3$
dalla lente di tubo. catturata, dopo aver attraversato un
\textit{beam-splitter}, da due sensori CMOS monocromatici
(Thorlabs DCC1545M).
La potenza viene suddivisa tra i due sensori secondo il rapporto
90:10. Il sensore che riceve la frazione maggiore di potenza sarà
utilizzato per il sistema attivo di stabilizzazione meccanica (descritto
in sezione \ref{sec:active_stab}), l'altro sensore verrà utilizzato
per mostrare costantemente su un monitor la situazione del campione.


\section{Fluorescenza}

\section{Pinzette ottiche}

Il fascio \textit{laser} collimato in uscita da una sorgente
\ce{Nd}:\ce{YVO4} attraversa immediatamente una serie di due isolatori
ottici, necessari per ridurre al minimo le instabilità della sorgente
dovute alla retro-riflessione.
Successivamente, dopo aver attraversato una lamina $\lambda/2$,
viene diviso in due  fasci ortogonali da un cubo polarizzatore.
I due fasci avranno polarizzazioni parallele o perpendicolari rispetto
alla superficie del tavolo ottico, e la lamina $\lambda/2$ consente di
modificare la ripartizione di potenza tra i due rami.
I due rami vengono ricombinati utilizzando un secondo cubo
polarizzatore, dopo aver attraversato due modulatori acusto-ottici
(\textit{Acousto Optic Modulator, AOM}).
Gli AOM vengono realizzati ponendo un cristallo di quarzo in contatto
con un trasduttore piezoelettrico: la radiofrequenza trasmessa al
trasduttore consente l'instaurazione di un onda stazionaria acustica
all'interno del cristallo, che si comporta sostanzialmente come un
reticolo di diffrazione. Variando l'ampiezza e la frequenza del segnale
elettrico inviato agli AOM è possibile modificare le caratteristiche
dell'onda acustica stazionaria nel cristallo, e quindi ottenere una
deflessione e una modulazione del fascio in uscita.

Gli elementi ottici sono allineati in modo che quanto a entrambi
gli AOM viene applicata una radiofrequenza di \SI{75}{MHz} i due rami
incidano perpendicolarmente sull'ultimo cubo polarizzatore e proseguano
il loro percorso esattamente sovrapposti (linea continua nella 
figura \ref{fig:aom}).

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics[width=\linewidth]{images/aom.pdf}
    \caption{Caption}
    \label{fig:aom}
\end{figure}

Una coppia di lenti piano-convesse con distanze focali di
\SIlist{??;??}{\mm} incrementa la dimensione del fascio e rende il 
piano focale posteriore dell'obiettivo coniugato con il piano
delle uscite degli AOM. In questo modo, per qualsiasi deflessione
angolare introdotta sui due rami i fasci delle due trappole
passeranno sempre collimati per il centro del piano focale posteriore
dell'obiettivo, con angolo d'incidenza dipendente dalla radiofrequenza
applicata. I fasci, quindi, attraversano l'obiettivo e vengono
focalizzati dentro il campione propagandosi parallelamente all'asse
ottico principale. La variazione di angolo di incidenza nel piano
focale posteriore dell'obiettivo si tradue in uno spostamento
orizzontale dei fasci nel piano del campione: in questo modo,
regolando la radiofrequenza degli AOM è possibile spostare la posizione
delle trappole lungo una linea orizzontale all'interno del campione.

I fattori di conversione tra posizione della trappola nel campione e
frequenza inviata all'AOM, determinati dalle caratteristiche degli AOM
e dalla geometria del sistema ottico, vengono determinati a posteriori
visualizzando microsfere intrappolate e creando rette di calibrazione.



\section{Force-clamp}


In figura \ref{fig:setup} è mostrato uno schema integrale
dell'apparato realizzato.
Le componenti principali sono descritte nella sezione \ref{sec:setup}.
Successivamente, nella sezione \ref{sec:stabilization} è descritto il
sistema di stabilizzazione meccanica introdotto per compensare lo
spostamento
del campione dovuto a deriva termica e oscillazioni acustiche.
Nella sezione \ref{sec:calibration} è descritta nel dettaglio la
procedura usata per la calibrazione dei parametri delle trappole
ottiche.

L'esperimento tipico utilizzato per studiare l'interazione tra una
proteina e un microfilamento di actina consiste in un saggio a tre
sfere, o \textit{3-beads assay}. I dettagli per la realizzazione di
questo esperimento sono illustrati nella sezione \ref{sec:3beads}.

\section{Apparato sperimentale}
\label{sec:setup}

L'apparato sperimentale è stato realizzato presso i laboratori del
LENS, sulla base dell'apparato utilizzato in precedenza dal di
Biofisica di Singola Molecola per lo studio delle interazioni tra
miosina e filamenti di actina e repressori della trascrizione
e filamenti di DNA.

L'apparto si compone di N parti principali:
\begin{description}
    \item[Pinzette ottiche:] Una coppia di fasci gaussiani a \SI{1064}{\nm}, ottenuti da un laser a stato solido, 
\end{description}



\begin{sidewaysfigure}
    \includegraphics[width=1.0\linewidth]{images/Setup.pdf}
    \caption{Caption}
    \label{fig:setup}
\end{sidewaysfigure}

\begin{sidewaystable}
    \centering
    \begin{tabular}{>{\tt}l l l >{\it}l l}
    \toprule
         Code & Type & Usage & Parameters & Product ID\\
    \midrule
    \multicolumn{5}{l}{\it Fluorescence Excitation Path}\\
        F-Clean635
            & Bandpass Filter
            & \SI{635}{\nm} laser clean-up
            & $\lambda_{centr}: \SI{640}{\nm},
              bw: \SI{14}{\nm}$
            & FF01-640/14-25\\
        L-TS1a
            & Plano-Convex Spherical Lens
            & Telescope for \SI{635}{\nm} laser
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-TS1b
            & & 
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-TS2a
            & 
            & Telescope for \SI{488}{\nm} laser
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-TS2b
            & & 
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        DIC-532
            & Single-edge Dichroic Filter
            & Excitation beam multiplexing
            & $\lambda_{edge}: \SI{532}{\nm}$
            & Di02-R532-25-D\\
        DIC-488
            & &
            & $\lambda_{edge}: \SI{488}{\nm}$
            & Di02-R488-25-D\\
        L-TS3a
            & Achromatic Doublet
            & Telescope for comb. ex. lasers
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-TS3b
            & & 
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-Exc
            &
            & Excitation beam focusing
            & f: \SI{0}{\mm} 
            & \\
        DIC-Fluor
            & Quad-edge Dichroic Filter
            & Excitation/Emission separation
            & $\lambda_{edge}: \SIlist{405;488;532;635}{\nm}$
            & Di03-R405/488/532/635-t1 \\
    \multicolumn{5}{l}{\it Tweezers Path}\\
        L-TS4a
            & Plano-Convex Spherical Lens
            & Telescope matching isolator size
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-TS4b
            & & 
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-TS5a
            & Plano-Convex Spherical Lens
            & Telescope after isolator
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-TS5b
            & & 
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-Twz1
            & Plano-Convex Spherical Lens
            & Telescope after isolator
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-Twz2  
            & & 
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        DIC-Twz1
            & Single-edge Dichroic Filter
            & Tweezer beam insertion
            & $\lambda_{edge}: \SI{1064}{\nm}$
            & \\
    \multicolumn{5}{l}{\it Imaging Path}\\
        L-Im1  
            & Tube Lens
            & Tube Lens
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        L-Im2  
            & Imaging Lens
            & Imaging Lens
            & f: \SI{0}{\mm}
            & \\
        DIC-BF
            & Single-edge Dichroic Filter
            & Fluorescence/Brightfield demux
            & $\lambda_{edge}: \SI{705}{\nm}$
            & FF705-Di01-25x36\\
        F-BlockBF
            & Shortpass Filter
            & Residual brightfield suppression
            & $\lambda_{cut}: \SI{700}{\nm}$
            & FESH0700\\
        F-Emiss
            & Quad-band bandpass Filter
            & Fluorophore emission filtering
            & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$
            & FF01-446/510/581/703\\
        F-BlockTwz
            & Bandstop filter
            & Fluorophore emission filtering
            & $\lambda_{centr}: \SIlist{446;510;581;703}{\nm}$
            & FF01-446/510/581/703\\
     \end{tabular}
     \caption{Caption}
     \label{tab:my_label}
 \end{sidewaystable}
 
 
 \section{Stabilizzazione meccanica}
 \label{sec:stabilization}