\chapter{Metodi}
\label{cap:methods}
 %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%% %%%%%%%%%
\section{Stabilizzazione meccanica}
\label{sec:stabilization}

Nonostante l'isolamento meccanico fornito dagli elastomeri e dal
tavolo ottico la posizione del campione rispetto al centro
dell'obiettivo e la quota del piano focale sono soggette a
fluttuazioni e derive.
Gli effetti più evidenti e rilevabili sono rapide oscillazioni della
posizione del campione dovute a vibrazioni acustiche residue e una
progressive deriva rispetto alla posizione fissata che diventa
significativa  ($> \SI{100}{\nm}$) per tempi di osservazione di
diversi minuti.

Per quantificare quest'effetto viene usato un apposito campione in cui
diverse microsfere in silice, di diametro \SI{0.5}{\um}, vengono 
immobilizzate in uno strato di nitrocellulosa depositato nella
superficie interna del vetrino coprioggetti.
Le varie fasi per la preparazione di questo campione sono descritte
nei particolari nell'appendice \ref{app:protocols}, protocollo
\ref{proto:silica_beads_flow_cell}.
 
Le microsfere immobilizzate nel campione possono essere messe a fuoco
e visualizzate attraverso il sistema di microscopia a luce trasmessa.
Una volta selezionata e messa a fuoco una microsfera, analizzando
l'immagine prodotta da uno dei due sensori CMOS è possibile calcolare
le coordinate (in pixel) del suo centroide:
 
\begin{equation}
     (x_{cen}, y_{cen}) =
        \frac{
            \sum_{(x, y)} (x, y) I(x, y)
        }{
            \sum_{(x, y)} I(x, y)
        }
\end{equation}
 
Per evitare di considerare altre microsfere o imperfezioni sul campione
si sceglie di effettuare il calcolo del centroide limitando la regione
dell'immagine utilizzata a un rettangolo nel quale una microsfera è
sufficientemente isolata.
 
Ricalcolando il centroide intervalli temporali fissati è possibile
osservare la deriva della posizione (x, y) della microsfera.
Inoltre è possibile sfruttare questo stesso campione per effettuare
una calibrazione del fattore di conversione pixel/nm lungo due assi 
ortogonali.

Per effettuare la calibrazione, dopo aver calcolato il centroide
della microsfera, si sposta la posizione dal campione lungo uno dei
due assi di una distanza ben definita, utilizzando il traslatore
piezoelettrico. A questo punto, calcolando la nuova posizione del
centroide si ottiene il rapporto tra lo spostamento comandato al
traslatore (in \si{\nm}) e la variazione del centroide (in pixel).
Ripetendo questa operazione in sequenza per vari punti si ottiene
una curva di calibrazione per l'asse scansionata, dalla quale è
possibile estratte la costante di proporzionalità con un \textit{fit}
lineare.

Risulta più complesso invece stimare la deriva del piano focale:
per questo motivo è stato sviluppato un metodo per determinare a
partire dalle immagini un valore che sia linearmente proporzionale
alla quota del piano focale rispetto al  centro della sfera.
Il metodo sviluppato sfrutta le caratteristiche dalla distribuzione
radiale della luce diffusa dalla microsfera.

In figura \ref{fig:radial_itensity} rappresentato l'andamento del
profilo radiale variando la quota del piano focale (z).

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics{images/radial_intensity.pdf}
    \caption{Profilo di indensità radiale rispetto al centroide
    per una microsfera, in diversi piani }
    \label{fig:radial_itensity}
\end{figure}
Da questi dati è stato possibile osservare che il rapporto tra
l'intensità integrata in un anello centrato sulla microsfera e quella
integrata nella regione interna al medesimo anello (regioni gialle
e arancioni in figura), mostra un andamento proporzionale alla quota
del piano focale, almeno in un certo intorno del centro della sfera.

In figura \ref{fig:z_est} viene mostrato l'andamento del rapporto
tra l'intensità media in un anello con raggio interno ed esterno
rispettivamente di \SIlist{80;160}{pixel} e l'intensità media
calcolata in un raggio di \SI{60}{pixel}.

\begin{figure}[ht]
     \centering
     \includegraphics[scale=0.8]{images/z-est.pdf}
     \caption{Andamento del rapporto intensità anello/cerchio in
     funzione della quota del piano focale.}
     \label{fig:z_est}
\end{figure}
 
Come si può osservare la quantità così definita può essere usata
per determinare la quota con una discreta sensibilità in
un intervallo di \SIrange{3}{4}{\um} intorno al centro della sfera.
Analogamente a quanto fatto per le assi x e y è possibile eseguire
una calibrazione spostando il campione di una quota controllata
attraverso il traslatore piezoelettrico dell'obiettivo, e costruire
una curva di calibrazione come quella in figura \ref{fig:z_est}.

Conoscendo quindi tre fattori di calibrazione è possibile, partendo
da un'immagine della microsfera, ottenere una stima della sua
posizione nello spazio tridimensionale. Questo fatto ci permette
di implementare un sistema attivo di stabilizzazione meccanica del
microscopio. Continuando a monitorare la sfera mediante mentre si
eseguono le misurazioni di forza è possibile rilevare gli spostamenti
del campione e compensarli inviando appositi comandi ai traslatori
piezoelettrici.

In ambiente LabVIEW è stato sviluppato un codice di controllo
che implementa un meccanismo di retroazione tra le letture sulla
posizione della sfera e i traslatori piezoelettrici.
Il codice consente all'operatore di selezionare la regione
d'interesse intorno a una microsfera immobilizzata sul vetrino
coprioggetti. Successivamente, quando la stabilizzazione viene
attivata, il codice acquisice diverse immagini della microsfera e
ne stima la posizione iniziale in termini di coordinate (x, y, z),
usando i fattori di conversione determinati con la calibrazione.
A questo punto viene avviato un ciclo di retroazione: continuando
a acquisire immagini della microsfera (a una frequenza che può
arrivare fino a \SI{100}{\Hz}), viene comandato ai traslatori
uno spostamento proporzionale alla differenza tra la posizione della
sfera rilevata e quella iniziale.

Quando il sistema di stabilizzazione meccanica viene attivato
è stato possibile mostrare che la posizione media del campione resta
stabile indipendentemente dal tempo di osservazione, con fluttuazione
che hanno una deviazione standard di circa \SI{1}{\nm}.
Introdurre nel ciclo di controlla alla componente proporzionale
una componente integrale o derivativa non altera significativamente
la stabilizzazione raggiunta.
Il fattore di proporzionalità del ciclo di retroazione
(guadagno, $g$) influenza
le caratteristiche della risposta del sistema: un fattore troppo
elevato causerà una sovracorrezione delle perturbazioni, inducendo
oscillazioni smorzate, mentre un fattore troppo piccolo aumenterà
inutilmente il tempo di risposta. Per trovare il valore ottimale
si osserva la risposta del sistema per diversi valori di $g$, in
seguito ad una perturbazione fittizia ottenuta modificando di
\SI{50}{\nm} il \textit{set point} lungo una direzione.
In figura \ref{fig:step_response} si riporta la risposta del
sistema di stabilizzazione per gli assi $x$ e $z$ a diversi valori
del fattore di proporzionalità $g$.

\begin{figure}
    \centering
    \includegraphics{images/step_response.pdf}
    \caption{Risposta del sistema a una perturbazione di \SI{50}{\nm} 
    lungo l'asse $x$ (sinistra) e $z$ (destra).}
    \label{fig:step_response}
\end{figure}

L'acquisizione di diverse tracce della durata di 5-10 minuti ha
sempre mostrato deviazioni standard delle fluttuazioni comprese
tra \SIlist{1;2}{\nm}.
In figura \ref{fig:active_stab} vengono riporati i tracciati delle
fluttuazioni della posizione del campione, con (nero) e senza
(rosso) l'intervendo del sistema di stabilizzazione attiva.

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics{images/active_stab.pdf}
    \caption{Deriva della posizione del campione con e senza sistema di
    stabilizzazione attivato.}
    \label{fig:active_stab}
\end{figure}

 
 \section{Calibrazione parametri trappole}
 \label{sec:calibration}
 
 Per poter eseguire misurazioni di forza su sistemi biologici è
 fondamentale riuscire a conoscere il valore della tensione applicata
 alle microsfere intrappolate nelle pinzette ottiche. Questo è
 possibile dal momento che l'azione di una pinzetta ottica su una
 microsfera può essere modellizzata come una forza di richiamo
 elastica (vedi sezione \ref{sec:ot}).
 
 Conoscendo la costante di richiamo è possibile mettere in relazione
 la posizione della sfera rispetto al centro della trappola
 (rilevabile tramite i QPD) con la risultante delle altre forze
 esterne che agiscono sulla microsfera.
 
 Quando la microsfera viene messa in movimento da una forza esterna,
 è necessario considerare anche l'attrito viscoso con
 il fluido in cui è immersa. La forza dovuto all'attrito viscoso
 avrà la forma:
 \begin{equation}
     \vec{F}_{visc} = - \gamma \vec{v}\
 \end{equation}
 
 Dove $\gamma$ è il coefficiente di attrito idrodinamico della
 microsfera.
 
 Nel caso più generele la microsfera sarà inoltre soggetta a una
 sforza stocastica ($\eta(t)$), dovuta agli urti con il fluido, e
 a una forza esterna $\vec{F}$, ad esempio dovuta alle tensione di una
 biomolecola legata ad essa.
 Possiamo quindi scrivere la forma più generale dell'equazione di moto
 come:
 
 \begin{equation}
    \label{eq:bead_motion}
     \underbrace{m \ddot{\vec{x}}}_\text{inerzia} =
     \underbrace{\vec{F}}_\text{f. esterna}
     + \underbrace{\mathbf{\eta}(t)}_\text{f. stoc.}
     - \underbrace{\gamma \dot{\vec{x}}}_\text{attrito}
     - \underbrace{k \vec{x}}_\text{richiamo}
 \end{equation}
 
 La forza stocastica $\eta(t)$ ha media nulla 
 ($\langle\eta(t)\rangle_t = 0$)
 e viene assunta con distribuzione di probabilità gaussiana con
 $\sigma^2 = 2 k_B T \gamma$.
 
 In condizioni di equilibrio la posizione media della microsfera
 sarà quindi:
 
 \begin{equation}
     \vec{x_0} = \langle \vec{x(t)} \rangle_t = - \frac{\vec{F}}{k} 
 \end{equation}
 
 E la deviazione standard delle fluttuazioni rispetto alla posizione
 di equilibrio può essere determinata usando il teorema di
 equipartizione dell'energia:
 
\begin{multline}
    \langle U(x) \rangle = \frac{1}{2} k \langle (x-x_0)^2 \rangle
    = \frac{1}{2} k_B T
    \\ \Longrightarrow
    \langle (x-x_0)^2 \rangle
    = \langle x^2 \rangle - \langle x \rangle^2
    = \sigma_x^2 = k_B T / k
\end{multline}
 
Oltre alla conoscenza di $k$ un altro valore importante da stimare
è il tempo di rilassamento $\tau$ del sistema, ovvero la scala
temporale nella quale la microsfera si stabilizza nella nuova
posizione di equilibrio a seguito di una variazione della forza $F$.
Questo tempo è strettamente legato allo smorzamento dovuto all'attrito
idrodinamico.
Osservando l'equazione di moto \ref{eq:bead_motion} si può
descrivere la dinamica della sfera in due regimi estremi:
\begin{itemize}
    \item il regime \textit{balistico}, quando il moto è dominato dalla componente inerziale, con un tempo caratteristico
    di rilassamento $\tau_\text{bal} = m / \gamma$.
    \item il regime \textit{diffusivo}, qunado il termine inerziale
    legato alla massa è trascurabile, con un tempo di rilasamento
    $\tau_\text{diff} = \gamma / k$.
\end{itemize}

Tenendo conto delle caratteristiche delle microsfere
si hanno  valori $\tau_\text{bal} < \SI{1}{\us}$, mentre
per i valori di $k$ ottenibili con il nostro sistema di pinzette
ottiche è possibile ridurre $\tau_\text{diff}$ fino a circa
\SI{100}{\us}.

Il tempo di risposta del sistema nel regime balistico è quindi 
completamente trascurabile, e il transiente tra una perturbazione
e la stabilizzazione nella nuova posizione di equilibrio può
essere descritto trascurando il termine inerziale dell'equazione di moto.
 
 Il protocollo di calibrazione sviluppato consente, partendo
 dalle tracce temporali della posizione relativa della
 microsfera un'asse spaziale, di determinare con precisione i
 valori di $\tau$, e quindi di $k$ per ogni posizione della
 trappola.
 
 Per fare questo si tiene contro che la densità spettrale
 delle fluttuazioni di posizione è data da \cite{Gittes1998}:
 
 \begin{equation}
     S_x(\nu) = \frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)}
 \end{equation}
 
 Dove $\nu_c = 1 / (2\pi\tau) = k / 2\pi\gamma$ é
 la frequenza di taglio, inversamente proporzionale al tempo
 di rilassamento.
 Da un semplice $fit$ della distribuzione spettrale di rumore
 della posizione è possibile quindi estrarre il valore di k.
 
 Il segnale misurabile in uscita dagli amplificatori differenziali dei QPD è un segnale in tensione,
 compreso tra \SIlist{-10;+10}{\V}, proporzionale alla
 posizione relativa della microsfera.
  Tramite il fit dei dati possiamo anche ottenere il fattore
 di conversione $\beta$ tale che $x_{rel}(V) = \beta V$.
 La distribuzione spettrale di rumore, riscalata rispetto alla
 variabile $V$ sarà quindi:
 \begin{equation}
     S_V(\nu) = \frac{1}{\beta^2}\frac{k_B T}{\pi^2 \gamma (\nu^2 + \nu_c^2)}
 \end{equation}
 
Per la calibrazione si procede a preparare un campione con una
cella di flusso contenente microsfere di polistirene (di diametro
\SI{0.9}{\um}).
Grazie a un'apposito programma sviluppato in ambiente LabVIEW
(\texttt{Force-Clamp Calibration}) è possibile acquisire in maniera
automatizzata le tracce del segnale prodotto dai QPD per una griglia
di posizioni delle trappole. Il codice si occupo di memorizzare
le tracce temporali per ogni posizione spostare la trappola modificando
la frequenza inviata agli AOM.

Le tracce temporali vengono acquisite per una durata di \SI{10}{\second} per ogni
posizione e una frequenza di campionamento di \SI{200}{kS/s}.
In seguito viene calcolata per ogni posizione di ciascuna
trappola la distribuzione spettrale di rumore, utilizzando un algoritmo
per la trasformata di Fourier veloce (\textit{Fast Fourier Transform}, FFT),
con i seguenti parametri riportati in tabella \ref{tab:fft_par}.

\begin{table}[ht]
    \centering
    \begin{tabular}{>{\bf}l l}
    \toprule
     Metodo di accumulo & Welch\cite{Welch1967} \\
     Segmenti accumulati & 32 \\
     Lunghezza segmenti & N/32 \\
     Finestra & Hann \\
    \bottomrule
     
    \end{tabular}
    \caption{Parametri FFT}
    \label{tab:fft_par}
\end{table}

Su ciascuno spettro viene eseguito un \textit{fit} per determinare
i valori di $\beta$ e $k$ imponendo i valori noti riportati in tabella \ref{tab:fit}.

\begin{table}[ht]
    \centering
    \begin{tabular}{l l l}
    \toprule
     Parametro & Simbolo & Valore \\
    \midrule
     Raggio della sfera & $R$ & \SI{450}{\nm} \\
     Temperatura & $T$ & \SI{295}{\K} \\
     Distanza sfera da superificie & $d$ & \SI{1}{\um} \\
     Viscosità & $\eta$ & \SI{1e-3}{Pl} \\
     Coefficiente attrido idrodinamico & $\gamma$ & $6 \pi \eta R \left(1+\frac{9R}{16d}\right)$\\
     Frequenza minima & $\nu_\text{min}$ & \SI{15}{\Hz} \\
     Frequenza massima & $\nu_\text{max}$ & \SI{50}{\kHz} \\
    \bottomrule
    \end{tabular}
    \caption{Parametri $fit$ distribuzione spettrale}
    \label{tab:fit}
\end{table}

In figura \ref{fig:psd} si riporta una distribuzione spettrale tipica
confrontata con la funzione teorica.

\begin{figure}[htpb]
    \centering
    \includegraphics{images/PSD.pdf}
    \caption[scale=0.7]{Densità spettrale di rumore per la posizione di una trappola
    ottica.}
    \label{fig:psd}
\end{figure}
 
Dai valori di $k$ e $\beta$ estratti per tutte le posizioni di ciascuna 
trappola è possibile interpolare i valori per ogni possibile posizione
intermeda. Per fare questo si usano delle funzioni polinomiali di ordine 3,
come mostrato in figura \ref{fig:trap_ccurves}.

\begin{figure}[htpb]
    \centering
    \includegraphics[scale=0.8]{images/calibration_curves.pdf}
    \caption{Andamento e interpolazione dei valori di $k$ e $\beta$.}
    \label{fig:trap_ccurves}
\end{figure}

 \section{\textit{Force-clamp} tramite ciclo di retroazione}
 \label{sec:force-clamp}

Un esperimento di \textit{force-clamp} consiste nello studiare la
dinamica e della formazione e della rottura del legame tra due
molecole quando queste sono sottoposte a una determinata 
forza di trazione costante.
Per poter applicare una tale forza attraverso una microsfera catturata
in una pinzetta ottica è stato implementato un sistema di retroazione
tra la lettura della posizione relativa della microsfera nella
trappola (dai QPD) e la posizione della trappola nel campione (tramite
gli AOM).
Scelto un valore per la forza (F) si può ricavare, conoscendo il
valore di $k$, il corrispondente spostamento $\Delta x$ rispetto al
centro della trappola.
Comandando agli AOM uno spostamento della trappola proporzionale
alla differenza tra la posizione relativa attuale della microsfera
nella e quella necessaria per ottenere la forza $F$ possono
verificarsi due situazioni:
\begin{itemize}
    \item Nel caso in cui la microsfera sia libera in soluzione,
    ovvero non vi sia applicata alcuna forza esterna, essa tenderà
    a muoversi sempre verso il centro della trappola (la sua posizione
    di equilibrio). Il sistema di retroazione quindi, per mantenere
    la sfera in un punto di non equilibrio a distanza $\Delta x$ dalla
    posizione di riposo dovrà continuare a muovere indefinitamente
    la posizione della trappola nella stessa direzione.
    \item Nel caso in cui la microsfera si leghi a delle molecole
    immobilizzate sulla superficie del campione, lo spostamento delle
    trappola si arresterà quando la forza esterna esercitata sulla
    microsfera, dovuta al legame, sarà tale da mantere $\Delta x$
    al valore fissato. In questo modo, alle due molecole legate,
    sarà applicata una tensione pari a quella selezionata.
\end{itemize}

\begin{figure}[ht]
    \centering
    \includegraphics{images/tension.pdf}
    \caption{\textit{Force-clamp} con una trappola.}
    \label{fig:tension}
\end{figure}

Osservando i tracciati temporali della posizione relativa della
microsfera è possibile individuare la transizione tra questi due
regimi, sia attraverso la velocità di variazione della posizione,
che possiamo ottenere derivando numericamente il segnale, sia dalla
variazione della deviazione standard delle fluttuazioni e del loro
spettro di rumore. Tramite un'analisi statistica di questi dati
per diversi valori di tensione selezionati è possibile caratterizzare
quantitativamente la dipendenza dalle sollecitazioni esterne del
legame analizzato.

Per realizzare sperimentalmente questa misura occorre un sistema
elettronico in grado di campionare il segnale prodotto dai QPD e
modificare di conseguenza la frequenza del segnale di modulazione invato
agli AOM.
Per garantire un funzionamento stabile e la possibilità
di rilevare eventi di durata confrontabile con il tempo di rilassamento
diffusivo si utilizza una scheda elettronica programmabile dedicata,
di tipo FPGA (\textit{Field Programmable Gate Array}), per controllare
il ciclo di retroazione.
In questo modo è possibile raggiungere una frequenz

 \section{Saggio a tre sfere}
 \label{sec:three-beads}

Visto che nelle giunzioni aderenti la trasmissione degli sforzi
meccanici è spesso media tra proteine filamentose (come la
\textit{F-actina}) risulta particolarmente utile sviluppare un
saggio in cui, usando due trappole, è possibile mettere in tensione
una proteina filamentosa, simulando ad esempio lo stato in cui si
può trovare la \textit{F-actina} nel citoscheletro.

\begin{figure}[h]
\centering
   \begin{subfigure}{0.45\linewidth}
   \centering
   \includegraphics[width=\linewidth]{images/three_beads_tension.pdf}
   \caption{}
   \label{fig:feedback-off} 
\end{subfigure}
\\[\baselineskip]
\begin{subfigure}{0.45\linewidth}
   \centering
   \includegraphics[width=\linewidth]{images/three_beads_fbON_unbound.pdf}
   \caption{}
   \label{fig:feedback-on-unbound}
\end{subfigure}
\hfill
\begin{subfigure}[H]{0.45\linewidth}
   \centering
   \includegraphics[width=\linewidth]{images/three_beads_fbON_bound.pdf}
   \caption{}
   \label{fig:feedback-on-bound}
\end{subfigure}
\centering
\caption{(a) Ciclo di retroazione disattivato, microsfere in posizione di equilibrio. La tensione del filamento può essere aggiustata modificando la distanza delle trappole. (b) Ciclo di retroazione
attivato, nessuna molecola immobilizzata legata al filamento. Le
trappole si muovono indefinitamente per ``inseguire'' la posizione
corrispondente alla forza richiesta. (c) Il filamento si lega con
una molecola immobilizzata sul vetrino, la microsfera raggiunge la
posizione target e lo spostamento delle trappole si arresta. La forza
applicata sul legame è pari a quella selezionata}.
\label{fig:three_beads}
\end{figure}

In figura \ref{fig:three_beads} è rappresentato lo schema realizzato
 
 \section{Fluorescenza di singola molecole}
 \label{sec:single_molecule_fluorescence}
 
 \section{TIRF e illuminazione a modi di galleria}
 \label{sec:gallery_mode}